松果菊苷对人脑胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响及机制

李镇宇，王兆涛，汪继，徐如祥

(南方医科大学附属陆军总医院，北京100010)

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，其中以胶质母细胞瘤恶性程度最高，手术难度大、复发率高、预后极差、病死率高[1]。胶质瘤细胞的迁移及侵袭导致胶质瘤的浸润性生长，难以与正常脑组织分清界限，提高了外科治疗的难度；同时侵袭周遭血管神经，导致患者预后极差。多种分子可以影响胶质瘤的迁移及侵袭，其中转化生长因子β(TGF-β)在此过程中发挥重要作用[3]。松果菊苷是一种提取自植物肉苁蓉的纯天然化合物，对结直肠癌、骨肉瘤、肝癌、乳腺癌[2]等多种肿瘤具有抑制作用，但其对脑胶质瘤的作用鲜有报道。近年来有文献报道，松果菊苷可以通过阻断TGF-β的传导，抑制肝星状细胞的激活，从而治疗肝硬化[4]。2017年4～12月，我们观察了松果菊苷是否可以通过阻滞TGF-β从而影响胶质瘤细胞的侵袭及迁移，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑胶质瘤细胞系U87、U251购于中国医学科学院基础医学研究所。松果菊苷购于美国Abcam公司；高糖DMEM培养基、10%胎牛血清、胰蛋白酶购于美国Gibco公司；青、链双抗均购于美国Hyclone公司；CCK-8检测试剂盒购于日本同仁化学研究所；Matrigel胶、Transwell小室购于美国Coming公司；结晶紫购于北京雷根生物科技有限公司；兔抗人TGF-β多克隆抗体购于美国CST公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体、山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗购于北京中杉金桥公司；TGF-β过表达质粒及其对照质粒均购于南京巴傲德生物科技有限公司；Lipofectamine3000转染试剂购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 细胞培养 将U87、U251细胞置于5% CO2、37 ℃培养箱中常规培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，每隔2～3 d加入0.025%胰酶消化传代1次。

1.3 细胞分组与处理 将细胞分为对照组、松果菊苷组、TGF-β过表达组、TGF-β过表达+松果菊苷组。常规消化并计数U87、U251细胞后，按1×105/孔接种于6孔板中。常规培养24 h后，使用Lipofectamine3000转染细胞。对照组、松果菊苷组转染空载质粒，TGF-β过表达组、TGF-β过表达+松果菊苷组转染TGF-β质粒。转染后24 h向松果菊苷组、TGF-β过表达+松果菊苷组中加入松果菊苷30 μmol/L，继续培养24 h后进行后续实验。

1.4 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。取各组细胞，用200 μL枪头在6孔板底垂直划线，用37 ℃预热的PBS冲洗未贴壁的细胞。培养箱中常规培养24 h后观察并摄影。使用Image J软件测定划痕面积，计算划痕愈合率，划痕愈合率=(1-24 h划痕面积/0 h划痕面积)×100%。每组重复3次。

1.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。取100 μL无血清高糖DMEM培养基稀释的Matrigel胶加入上室中，培养箱中孵育6 h。取各组细胞制成悬液，调整细胞密度为5×104/mL，取200 μL加入上室中；下室中加入600 μL培养液稀释的高糖DMEM培养基，每组重复3次。培养箱中常规培养24 h后，擦去上室表面细胞，甲醇固定。0.1%结晶紫溶液染色，清水清洗。风干后每个小室随机选取3个视野拍照，显微镜下计数穿膜细胞数，取平均值。

1.6 细胞TGF-β蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每孔上样量为40 μg。10% SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭液(1×TBST稀释的5% BSA)封闭1 h。加入兔抗人TGF-β、鼠抗人GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜。ECL化学发光法曝光显影。采用Image J分析条带的灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH灰度比值表示TGF-β蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞迁移能力比较 在U87、U251细胞中，松果菊苷组划痕愈合率较对照组降低，TGF-β过表达组较对照组升高；TGF-β过表达+松果菊苷组较TGF-β过表达组降低，较松果菊苷组升高(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组细胞侵袭能力比较 在U87、U251细胞中，松果菊苷组穿膜细胞数较对照组减少，TGF-β过表达组较对照组增加；TGF-β过表达+松果菊苷组较TGF-β过表达组减少，较松果菊苷组增加(P均<0.05)。见表2。

表1 各组细胞划痕愈合率比较

注：与松果菊苷组比较，*P<0.05；与TGF-β过表达组比较，△P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05。

表2 各组穿膜细胞数比较(个，

注：与松果菊苷组比较，*P<0.05；与TGF-β过表达组比较，△P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05。

2.3 各组细胞TGF-β蛋白表达水平比较 在U87、U251细胞中，松果菊苷组细胞TGF-β蛋白表达量较对照组降低；TGF-β过表达组较对照组升高；TGF-β过表达+松果菊苷组较TGF-β过表达组降低，较松果菊苷组升高(P均<0.05)。见表3。

表3 各组细胞TGF-β蛋白表达水平比较

注：与松果菊苷组比较，*P<0.05；与TGF-β过表达组比较，△P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05。

3 讨论

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，占成人原发性颅内肿瘤的70%，其中以胶质母细胞瘤恶性程度最高，预后很差，并存在极高的复发率[1]。其生长迅速并且浸润程度高，常侵袭瘤周正常脑组织，包括重要的生命调控中枢及神经和血管，且外科手术治疗存在巨大困难，各种原因导致肿瘤难以切尽，大面积的清除常使患者功能区受到损害，因此胶质瘤手术以姑息手术为主。这是胶质瘤患者预后差、复发率高的一个重要原因。目前，药物化疗特别是药物靶向性化疗是胶质瘤最重要的治疗环节之一，然而临床应用表明，胶质瘤化疗效果并不理想。大部分抗肿瘤药物因难以透过血脑屏障，不能在中枢中保持有效的浓度，无法发挥其药理作用。临床应用的化疗药物仍局限于替莫唑胺少数几种药物，且因这类药物的易耐药性和高不良反应，临床应用也存在一定的局限性[6]。我国传统中草药具有不良反应小、易获取、成本低等诸多优点，其对肿瘤的疗效也得到了部分临床证实。从中草药中筛选有效的肿瘤治疗药物是目前研究的一个重要发展方向。

松果菊苷是从肉苁蓉根部提取的纯天然化合物，其主要活性成分为苯乙醇苷类化合物[7]。肉苁蓉作为中草药在我国有着几千年的应用历史，其被证实存在多种生物效应，包括神经保护作用[8]、保肝作用[9]、抗细胞凋亡[10]、抗衰老[11]、免疫调节[12]等，且具有良好的透过血脑屏障的功能，并能在脑内维持稳定的有效浓度[13]。最新研究表明，松果菊苷可通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[2]。在结直肠癌中，松果菊苷能通过上调caspase-3和裂解DNA修复酶诱导DNA氧化，从而诱导肿瘤细胞凋亡[14]。Dong等[15]报道，松果菊苷可通过Mut T同源酶1(MTH1)的催化活性来发挥抗肿瘤作用。但该药物对胶质瘤的作用罕有报道。本研究结果显示，松果菊苷组细胞划痕实验的划痕愈合率、Transwell小室实验的穿膜细胞数均较对照组降低，提示松果菊苷能够明显抑制胶质母细胞瘤的迁移和侵袭能力，表明松果菊苷具有抗胶质母细胞瘤的作用。

TGF-β在胶质母细胞瘤中呈高表达[16]，是促进肿瘤细胞迁移和侵袭的重要分子之一。TGF-β属于转化生长因子超级家族，是一种多功能细胞因子，其信号通路是一条极为重要的细胞内信号转导途径，能够调控多种不同的细胞生物学效应，包括细胞增殖、分化、迁移和黏附、凋亡等。研究表明，TGF-β能够通过影响肿瘤微环境、增强侵袭性和抑制免疫细胞功能来促进肿瘤细胞转移。TGF-β信号通路与肿瘤发展之间密切的联系使得TGF-β信号转导通路成为肿瘤治疗的新靶点，其在抑制肿瘤发生转移机制过程中具有重要意义。目前，针对TGF-β及其受体的靶向药物正在逐步开发中[17]。本研究发现，松果菊苷组细胞TGF-β蛋白表达量较对照组降低，TGF-β过表达+松果菊苷组较TGF-β过表达组降低。提示应用松果菊苷可以下调胶质母细胞瘤中TGF-β蛋白的表达，在过表达TGF-β胶质母细胞瘤中，松果菊苷对细胞迁移、侵袭及TGF-β蛋白表达量均产生了部分逆转。进一步证实，TGF-β是松果菊苷抑制胶质母细胞瘤迁移和侵袭的重要靶点。因此，我们认为松果菊苷可以在体外抑制胶质母细胞瘤的迁移和侵袭，为松果菊苷的临床应用奠定了理论基础。