中欧蔬菜农药残留检测方法差异及应对

王 坦，刘福光，董茂锋，王伟民，陈珊珊，戚亚梅，郭林宇，宋卫国,

（1.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海市农产品质量安全评价技术服务平台，上海 201403；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081）

蔬菜作为我国重要的出口农产品之一，不仅在农业产业结构调整中占有重要地位和作用，在农民收入稳定增长和农业产业竞争力持续提升中也有重要作用。随着我国农业“走出去”战略和“一带一路”战略的加快推进，以及蔬菜产业竞争力的稳步提升，我国蔬菜国际贸易有继续扩大的趋势[1]。而我国作为发展中国家，科技水平相对较低，蔬菜生产加工过程和方法、残留物质检测方法等许多方面还不完善，导致我国蔬菜出口欧盟市场受到欧盟技术性贸易措施的制约。中国技术性贸易措施网数据显示，欧盟食品和饲料类快速预警系统（rapid alert system for food and feed，RASFF）通报的蔬菜产品由于农药残留、兽药残留、重金属、微生物等原因导致的召回、销毁数量巨大。2015年，欧盟、美国、加拿大、日本、韩国扣留（召回）我国不合格消费类产品总计2 132 批次。其中，欧盟召回消费类产品共计1 273 批次（欧盟健康消费者保护总司召回1 151 批次，欧盟食品和饲料委员会召回122 批次），占消费类产品被召回总批次的59.7%，欧盟是我国产品出口受到技术壁垒制约最严重的地区[2]。上海关区2011—2015年出口至欧盟的蔬菜从1.67万 t逐年递减至0.61万 t，贸易额从5 134万 美元递减至1 829万 美元。

目前，中欧农药残留标准差异研究大多集中在农药最大残留限量（maximum residue limits，MRL）上，且有不少文章报道[3-6]，但对于农药残留检测方法的对比研究较少。本文通过研究中欧蔬菜贸易受阻的典型产品，分析中欧农药残留标准检测方法的差异，旨在为提高我国农药残留检测水平和出口蔬菜质量提供技术支持。

1 农药残留对我国蔬菜出口欧盟的影响分析

近年来，我国蔬菜出口欧盟受到技术性贸易措施的制约，给我国优质蔬菜出口企业造成严重的经济损失。通过中国技术性贸易措施网上的数据整理，2014年1月至2016年12月欧盟食品和饲料类RASFF通报中，中国出口至荷兰、波兰、英国、意大利和西班牙等国家的蔬菜产品由于农药残留超标而受到限制。其中，西兰花在所有受到制约的蔬菜产品中所占比最大，见表1。

表1 RASFF对华拒绝进口通报（2014—2016）[7]Table1 Notification of refusal to import from China of RASFF(2014–2016)[7]

续表1

2 中欧蔬菜中农药残留检测方法对比

2.1 中欧农药残留检测方法数量对比

我国2016年12月最新发布的食品中农药MRL标准GB/T 2763—2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[8]中共收录了433 种农药的4 140 项MRL和163 项检测方法标准，其中国家标准91 项，行业标准72 项。此标准中涉及蔬菜的农药残留标准检测方法共97 项，其中国家标准51 项，行业标准46 项，包括60 项单残留检测方法（single residue methods，SRM）和37 项多残留检测方法。

欧盟目前共有79 项标准检测方法，涉及481 种农药。其中水果和蔬菜（fruits and vegetables，FV）19 项，谷物饲料（cereals and feeding stuff，CF）22 项，动物源食品（food of animal origin，AO）4 项，SRM 34 项[9]。其中涉及蔬菜中的农药残留检测方法为19 项FV方法和24 项SRM。

以西兰花为例，我国GB/T 2763—2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[2]中西兰花的检测方法标准共7 项，其中国家标准5 项，农业行业标准2 项；按照检测方法分为多残留检测方法5 项和SRM 2 项。欧盟西兰花中农药残留检测方法共43 项，包括19 项FV标准检测方法以及24 项SRM。欧盟的农药残留检测方法标准体系相对简单清晰，其标准检测方法按照FV、CF、AO以及农药单残留检测来分类，方法数量和重叠率较少。因此，欧盟检测方法标准体系为检测方法的选用以及标准体系的统一化和标准化带来了优势。

我国检测方法标准除国家标准、行业标准之外，还有众多的地方标准和企业标准，这4 种级别的标准按照严格程度排序为：国家标准＜行业标准＜地方标准＜企业标准。4 类标准共同组成了我国的农药残留检测方法标准体系。该体系具有数量多、分类多的特点，且4 类标准之间有重叠现象。

2.2 中欧蔬菜中农药残留检测标准方法结构对比

按照2016年4月发布的农业部2386号公告《农药残留检测方法国家标准编制指南》[10]，我国农药残留检测方法标准的结构为：1）资料性概述要素：封面、前言、引言；2）规范性一般要素：标准名称、警告、范围、规范性引用文件；3）规范性技术要素：原理、试剂与材料、仪器和设备、抽样、试样制备、分析步骤、结果计算、精密度、图谱、质量保证和控制；4）资料性附录；5）规范性附录。其中，封面、前言、标准名称、试剂与材料、仪器和设备、试样制备、分析步骤、结果计算、精密度和图谱为必备要素，其他为可选要素。指南中详细规定了每部分编写的格式规范。

欧盟农药残留检测方法分为方法开发报告（method development report，MD）、方法验证报告（method validation report，MV）和分析观察报告（analytical observation report，OB）。方法标准一般分为7 部分：1）目的和范围；2）方法简介；3）设备和耗材；4）化学品；5）方法步骤：样品制备、添加标准品进行回收率测定、提取、仪器分析、仪器条件；6）方法验证：回收率和实验室内再现性、检出限、标准曲线线性系数、基质效应等；7）引用标准。附录中含有：1）质谱参数；2）验证结果：线性参数、检测浓度范围、基质效应、回收率、最低定量限等。

通过对比可以看出，在格式框架上，中欧标准方法基本相同，我国标准相比欧盟多了农药及相关化学品中英文名称对照索引部分，而方法验证部分不如欧盟标准全面。这是由于我国的方法验证部分在方法的编制说明中具体描述，并不公布在方法标准里面。我国标准方法的编制说明要求对该方法的制定过程进行详细描述，并对方法的准确度、精密度和稳定性进行实验室内和实验室间的验证，从而确保该方法的有效性、重复性、准确度和灵敏度。

2.3 蔬菜样品检测技术内容对比

我国蔬菜多残留检测方法中，GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450 种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》[11]、GB 23200.8—2016《食品安全国家标准 水果和蔬菜中500 种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》[12]以及NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[13]3 项方法标准最为简便常用。常用的标准检测方法步骤一般为：均质样品经乙腈匀浆提取，盐析离心，固相萃取柱净化，使用气相色谱（gas chromatography，GC）、液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）或气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定，外标法定量；或试样用水-丙酮均质提取，经二氯甲烷液-液分配，以凝胶色谱柱净化，再经活性炭固相柱净化，洗脱液经浓缩及溶解定容后，供GC-MS测定和确证，外标法定量（表2）。

表2 中国蔬菜农药残留检测方法标准Table2 Standard methods for determination of pesticide residues in vegetables in China

欧盟的蔬菜检测方法以QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）方法或改良的QuEChERS为主。例如EURL-FV (2014-M15) Pesticide analysis in fruits and vegetables by microflow liquid chromatography coupled to mass spectrometry[18]方法，其前处理操作如下：称取10 g均质样品加入10 mL乙腈提取，加入内标，振荡提取4 min，加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠（柠檬酸盐缓冲体系），振荡提取4 min，离心分层，取5 mL上清液用0.75 g无水硫酸镁、0.125 g PSA、0.125 g C18柱净化，漩涡振荡30 s后离心。提取液中加入50 µL 5%甲酸乙腈（提高贮存稳定性），用乙腈∶水（20∶80，V/V）稀释30 倍后过膜，使用LC-MS/MS检测。欧盟水果蔬菜的标准检测方法详见表3。

中欧农药残留检测前处理方法均包含传统的液-液萃取方法，我国的前处理方法使用固相萃取方法居多，而欧盟的前处理方法多数使用以QuEchERS方法为代表的基质分散固相萃取方法。另外，欧盟标准方法中内标法使用较为广泛。QuEchERS方法是基于固相萃取和基质固相分散技术开发出来的新一代用于农产品检测的快速样品前处理技术[34]。回收率、精密度和准确度高，可分析的农药范围广、溶剂使用量少、污染小、装置简单、操作简便、节省时间和人力。

表3 欧盟蔬菜农药残留检测方法标准Table3 Standard methods for determination of pesticide residues in vegetables in the EU

仪器检测方面，首先，我国目前部分标准方法仍使用LC或GC，而欧盟和美国要求农药残留的确认必须要有质谱数据。农药残留检测过程中，即使样品经过了净化，在残留浓度很低的情况下，其基质本底对检测结果造成的干扰也是不可忽视的；因此仅依靠保留时间进行定性分析具有不确定性，必须有质谱数据，即化合物结构信息，才能进行更准确的判定。并且由于单四极杆质谱很难获得需要的碎片离子和有效避免基质干扰，而QqQ在多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）模式下运行具有良好的基质抗干扰能力和较宽的线性范围，因此LC-MS和GC-MS也正在被LC-QqQ和GC-QqQ取代[35]。其次，我国的农药残留检测方法标准中除了LC-MS/MS、超高效液相色谱-QqQ及GC-MS/MS外，尚未采用更加精密的仪器，例如LC-TOF-MS等。欧盟从2014年开始，就引用了更加先进的LC-TOF-MS对不同基质中的农药残留进行检测识别。综上所述，我国农药残留检测的仪器发展尚不成熟，与欧盟等发达国家和地区还存在差异。

2.4 中欧蔬菜中农药残留检测方法质量控制对比

我国蔬菜中农药残留检测标准方法的方法质量控制按照农业部2386号公告《农药残留检测方法国家标准编制指南》[10]附录A中方法性能与质量控制部分进行。包括方法的提取效果、方法的特异性、标准工作曲线、正确度、精密度（包括重复性和再现性）、定量限、验证试验。校准曲线的浓度范围尽可能覆盖2 个数量级，至少做5 个平行（不包括空白），包括定量限、MRL或10 倍定量限。对于筛选方法，线性回归方程的相关系数不低于0.98，对于确证方法，相关系数不低于0.99。方法的正确度是指所得结果与真值的符合程度，农药残留检测方法的正确度一般用回收率进行评价。回收率实验一般应做3个水平，每个水平重复不少于5 次，计算平均值。精密度是指在规定条件下，独立测试结果间的一致程度。方法的精密度包括重复性和再现性：重复性是指在同一实验室，由同一操作者使用相同设备、按相同的测试方法，并在短时间内从同一被测对象取得相互独立测试结果的一致性程度。每种试材都应做重复性实验，重复性要做3 个水平，添加水平同回收率，每个水平重复不少于5 次。再现性是指在不同实验室，由不同操作者按相同的测试方法，从同一被测对象取得相互独立测试结果的一致性程度。实验应在不同实验室间进行，实验室不少于3 个（不包括标准起草单位）。再现性做3 个添加水平实验，其中一个添加水平必须是定量限，添加水平同重复性，每个水平重复不少于5 次。定量限是指可以进行准确定性和定量测定的最低水平，在该水平下得到的回收率和精密度应满足以上回收率和精密度的要求。验证项目包括方法使用的所有基质材料的回收率、精密度和定量限。附录B对样品预处理、样品制备、样品贮存进行了规定。

欧盟目前根据2015年修订的DG SANCO/11945/2015 Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed[36]文件从取样到验证实验做了周详严格的规定。从而保证标准方法质量。中欧方法质量控制具体对比见表4。欧盟所有官方检测实验室，尤其是欧盟实验室被强制要求参加能力测试，如果出现假阳性、假阴性或精密度不达标的实验结果，测试结果为不合格，并要查明原因，直到得到满意的数据结果才可以继续进行其他目标化合物和基质的测试，以保证实验室的检测能力。欧盟规定在分析过程中需要对数据进行定量校准，包括单水平定量、多水平定量、多种标准物质校正、基质标准、标准品混合效应影响、程序标准、混合内标等校准方法。在数据报告部分中规定了有效数字位数和不确定度，欧盟对不确定度根据国际标准ISO（Anonymous 1995,Guide to the expression of uncertainty in measurement ISBN 92-67-10188-9）或Eurachem/CITAC Guide, Quantifying uncertainty in analytical measurement, 3rdEdition, 2012进行评估，不确定度不仅对再现性相对标准偏差（relative sandard deviation，RSD）进行评估，还要包括样品制备、处理、二次抽样等过程中的差异所引起的其他不确定因素，此外，实验室内的能力验证结果也可以作为实验室不确定度的参考依据。方法验证要求对方法的灵敏度、平均回收率、精密度和定量限进行验证。回收率和精密度重复5 个平行，添加至少2 个水平，低水平为定量限，高水平为2～10 倍定量限或MRL。对于定量方法，实验结果要求回收率为70%～120%，RSD＜20%，线性系数R2＞0.99；对于筛选方法，要求至少需要95%的分析物能检出，即漏检率小于5%。定量限为满足回收率和精密度要求的最低浓度。

表4 中欧蔬菜中农药残留检测标准方法的方法质量控制对比Table4 Comparison of quality control of the methods used for pesticide residue determination in vegetables in China and the EU

综上所述，欧盟DG SANCO/11945/2015 Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed[36]相对我国的编制指南，对于农药残留检测方法的样品、前处理、仪器分析、质量控制、数据报告、方法验证等各项规定更加完善和全面，内容也相对详尽充实，对于标准方法的编制具有很强的指导性。而且欧盟的指导文件更新较快，每两年更新一次，技术标准要求严格。

3 应对欧盟技术性贸易措施的建议

3.1 缩减检测方法标准数量，整合相似的方法标准

我国农药残留检测方法标准较多，国家标准、行业标准、地方标准、企业标准之间有重叠，不利于农药残留检测体系的标准化。而欧盟不同农药按照不同基质，将检测方法进行分类，一种农药针对不同基质选用适合的检测方法，总的方法数量较少，便于进行方法验证和农药残留检测工作的标准化。

3.2 提高方法前处理效率

欧盟的提取方法一般是有机溶剂提取，漩涡振荡5 min进入下一步分析，非常节省时间；我国部分标准方法使用振荡等提取方式，少则0.5 h，多则1 h，耗时较长。

欧盟选用分散固相萃取的净化方法，该方法可以简化净化流程，缩短前处理时间，且方法简便，节省人力物力，实验结果准确度和精密度较高；我国标准方法选用固相萃取柱净化的方式较多，需选择对应的固相萃取柱，配制活化溶液、洗涤溶液以及洗脱溶液，而农药的净化和洗脱效果与实验操作有很大关系，准确度和精密度易受到操作人员水平的影响，且方法相对耗时。因此，建议我国标准方法引入或开发成熟的分散固相萃取方法用于前处理操作。

3.3 提高方法精密度和灵敏度

随着新型农药的不断出现，农药种类的增多，检测样品品种不断增加，残留限量不断降低，对于检测方法提出了更高的要求。目前世界上检测仪器发展迅速，新的离子源技术、更高灵敏度、抗干扰能力、抗污染能力以及更高通量检测将是MS/MS技术发展的方向。而MS/MS中QqQ串联线性离子肼质谱将QqQ扫描方式和灵敏的线性离子阱扫描结合起来，在获得MRM数据的同时采集二级全扫描图谱增强MS/MS的定性能力，提高方法的灵敏度[35]。因此，我国在检测仪器方面需要与欧盟等发达国家看齐，农药残留检测方法制修订应注重引用或开发与先进国家相配套的先进仪器，提高方法的准确度和灵敏度，使我国的检测方法标准与国际领先标准同步。

3.4 对方法质量控制的进一步规范

我国目前使用农业部2386号公告中的《农药残留检测方法国家标准编制指南》[10]来进行农药残留检测方法标准编制工作，包括标准文本和编制说明两部分。该指南侧重于标准格式规范，对方法质量控制、性能参数、样品预处理和保存等作了相应的规定，通过对比，欧盟的DG SANCO/11945/2015 Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed[36]对于农药残留检测的每一步操作及如何进行质量控制的规定更加明确和详尽，对“从农田到餐桌”整个过程进行了质量控制。我国的编制指南应增加农药残留检测方法各步骤的详细标准和规范，从而指导和监督标准方法编制人员进行方法编制和验证工作，推动我国农药残留检测方法标准化水平，提高出口产品质量，应对欧盟技术性贸易壁垒的限制。