蛋清源活性肽抗氧化及抗炎活性

张 燕，魏汝君，潘风光，刘 珍，王寒松，刘静波

（吉林大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130062）

随着经济发展，人们知识水平和生活水平不断提高，人工合成抗氧化剂的安全性受到广泛质疑，因此引发人们对天然、安全来源的抗氧化剂研究的极大关注[1]。生物活性肽具有比氨基酸和蛋白质更强的生物活性和多样性，更易吸收并且安全可靠，已成为国内外科技工作者的研究热点和重点[2-5]。

长期以来，氧化应激被认为是细胞内氧化剂与抗氧化剂之间失衡的状态，当活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）积累过多，就会导致细胞及组织的氧化损伤。所有生物都有受到氧化应激的可能性。在生物体内少量自由基有积极的影响，但长期处于高含量自由基的环境中，可能导致机体重要的生物大分子遭到破坏，引发DNA突变，造成机体器官组织等的损伤并引发疾病。大量研究表明氧化应激与多种慢性病和急性病有着密切的联系，常见的有心血管疾病、癌症、神经紊乱、糖尿病、缺血再灌注和衰老[6-8]。研究报道ROS参与了一些人类退行性疾病的病因学，包括炎症、心血管和神经性的紊乱及癌症。而生物活性肽以多种方式发挥其抗炎、抗氧化的特性，包括清除自由基、抑制ROS的产生以及抑制促炎细胞因子的释放等[9-13]。

禽蛋蛋白质含量丰富，且其氨基酸组成与人类必需氨基酸比例接近，是获取生物活性肽的良好资源。因此，本实验从细胞水平考察了蛋清源抗氧化肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化应激的抑制作用及抗炎效应，为预防氧化应激可能对人体造成的伤害提供新的思路，为鸡蛋在食品深加工、制药和化妆品等应用中提供理论依据，并有助于人们深入了解机体氧化应激状态的机制和根本原因，进一步为增加蛋品多方面利用价值和提高蛋品利润创造空间。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋清源肽（＞95%） 上海强耀生物科技有限公司；Trolox（分析纯）、2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美国Sigma公司；人胚肾细胞（HEK293） 中国科学院细胞库；DMEM培养基美国Gibco公司；H2O2（分析纯） 天津化学有限公司；MTS单细胞溶液增殖检测试剂盒 美国Promega公司；还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized GSH，GSSH）检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α酶联免疫吸附分析试剂盒 武汉伊艾博科技有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；多功能酶标仪美国伯腾仪器有限公司；黑色孔板（透明平底） 德国Greiner Bio-One公司；移液器 德国Eppendorf公司；超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；二氧化碳培养箱 上海力申科学仪器有限公司；低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；倒置生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清源活性肽对ABTS＋•清除活性测定

ABTS与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS＋•。在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的吸光度下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力。ABTS＋•清除活性按照实验室已建立的方法[14]进行测定，并略有修改。取10 mg ABTS于蒸馏水中配制成7 mmol/L的ABTS溶液，与过硫酸钾溶液（终浓度为2.45 mmol/L）按1∶1的体积比混合即得ABTS储备液，使用前需在室温条件下避光放置12～16 h。测定前用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释ABTS储备液至吸光度为0.70±0.02，即为ABTS工作液，现配现用。实验分为3 组，每个样品浓度3 个复孔。空白组：每孔加200 µL PBS；对照组：每孔180 µL ABTS工作液、20 µL PBS；实验组：每孔180 µL ABTS工作液、20 µL肽溶液（终浓度分别为1、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L）。以Trolox溶液作为标准参照物，设置系列浓度梯度的Trolox溶液（10、20、50、100 µmol/L）与ABTS工作液反应，以Trolox浓度为横坐标，ABTS＋•清除率为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算Trolox抗氧化当量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC），即被测抗氧化剂清除ABTS＋•的能力（吸光度大小的变化）与标准抗氧化剂Trolox清除ABTS＋•能力的比值。从而确定各条肽的相对抗氧化活性。ABTS＋•清除率根据下式计算。

式中：A1、A2、A3分别为实验组、对照组、空白组的吸光度。

1.3.2 蛋清源抗氧化肽对HEK293 细胞氧化损伤的保护作用

1.3.2.1 HEK293细胞氧化损伤模型的建立

接种密度为5.0×104cells/mL的HEK293细胞于96 孔板中。分别设置空白组、对照组和实验组，空白组每孔加100 µL培养基；对照组加90 µL细胞混悬液和10 µL培养基；实验组各孔加90 µL细胞混悬液。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后，实验组分别加入10 µL终浓度为200、300、400、500、600、700、800、900 μmol/L的H2O2（每个浓度设置6 个复孔），继续孵育24 h后，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS）法[15]测定细胞存活率，当细胞存活率为50%时，对应的H2O2浓度即为建立HEK293细胞氧化损伤模型的最佳损伤浓度。

1.3.2.2 蛋清源活性肽对H2O2氧化损伤的HEK293细胞的保护作用

将密度为6.0×104cells/mL的HEK293细胞接种于96 孔板中，每孔接种80 µL。分别设置空白组、对照组、损伤组和保护组，空白组加100 µL培养基；对照组加入80 µL细胞混悬液和20 µL培养基；损伤组和保护组都加80 µL细胞混悬液，每个实验浓度设置6 个复孔。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后，保护组加入10 µL终浓度1、10、20 、30、40、50、60 μmol/L的蛋清肽溶液，即WNWAD（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）、WNW（Trp-Asn-Trp）、WAD（Trp-Ala-Asp）、WN（Trp-Asn）、AD（Ala-Asp），同时损伤组加入10 µL培养基，继续孵育24 h后损伤组和保护组同时加入10 µL终浓度为400 μmol/L的H2O2溶液，继续孵育12 h后，MTS法测定细胞存活率。

1.3.3 GSSG含量与GSH/GSSG比值的测定

将HEK293细胞接种于6 孔中，细胞密度为5.0×105cells/mL，每孔接种量为1.5 mL。分别设置空白组、对照组、损伤组和保护组，空白组加1.5 mL培养基；对照组加入1.0 mL细胞混悬液和500 μL培养基；损伤组和保护组各加1.0 mL细胞混悬液，每个实验浓度设置6 个复孔。5% CO2培养箱中孵育24 h后保护组加入250 µL终浓度为1、5、10 μmol/L的蛋清源活性肽WNWAD溶液，损伤组加250 µL培养基。5% CO2培养箱中继续孵育24 h后损伤组和保护组同时加入250 µL终浓度为400 μmol/L的H2O2溶液。继续孵育12 h后按照GSH和GSSG检测试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 IL-8与TNF-α酶联免疫吸附测定分析

细胞分组及培养同1.3.3节，继续孵育12 h后按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN、AD对ABTS＋·清除活性的影响

ABTS＋·清除法被各研究机构广泛应用于食品和天然水溶性酚类物质抗氧化活性的测定[16]。以Trolox为标准参照，得ABTS＋·清除率标准曲线（未给出）及拟合方程为y＝0.952 4x＋4.342 9，R2＝0.990 1，两者呈现良好的线性关系。由图1可知，蛋清源肽WNWAD、WNW、WAD、WN随着浓度的增加，其清除ABTS＋·能力也逐渐递增，而肽AD无ABTS＋·清除能力。在浓度为40 μmol/L时，WNWAD清除ABTS＋·能力最强，TEAC为（98.411±0.020）μmol TE/L，其次为WN、WNW、WAD，其TEAC分别为（96.629±0.008）、（94.978±0.003）和（88.807±0.003）μmol TE/L。Hernández-Ledesma等[17]将发酵乳中水溶性部分通过反相高效液相色谱进行分离得到抗氧化肽，研究其抗氧化活性和降压活性，得到His、Pro（疏水性氨基酸）对抗氧化的影响最大；Trp（疏水性氨基酸）、Tyr对ABTS＋·清除的贡献最大，因为这类氨基酸的吲哚基和苯环可供氢。研究发现含疏水性氨基酸（如Ala、Val、Leu）的抗氧化肽活性与这些分子中特定的疏水性氨基酸残基与脂或脂肪酸的亲和性相关。而ABTS＋·清除能力较强的4 条肽都含有Trp，其中的N—H键易发生均裂，产生氢自由基（H•），即是氢供体。

图1 蛋清源活性肽清除ABTS＋·能力Fig. 1 Trolox equivalent antioxidant capacity of peptides from egg white proteins

2.2 HEK293细胞氧化损伤模型的建立

图2 不同浓度H2O2对HEK293细胞相对存活率的影响Fig. 2 HEK293 cells relative viability under H2O2 treatment

H2O2是一种活性氧，可引发脂质过氧化从而增强氧化应激，最终可导致细胞损伤甚至死亡[18]。由图2可知，随H2O2浓度升高，细胞存活率逐渐降低，即氧化损伤作用逐渐加强。H2O2终浓度为400 μmol/L时HEK293细胞相对存活率为（50.240±0.505）%，与对照组相比有高度显著性差异（P＜0.001），而H2O2终浓度为900 μmol/L时细胞存活率仅为（10.404±0.831）%，由于氧化应激过于严重导致存活率极低。综合考虑，以400 μmol/L的H2O2浓度作为诱导损伤模型的最佳浓度。

2.3 蛋清源活性肽对H2O2诱导的HEK293细胞氧化损伤的影响

2.3.1 不同浓度WNWAD、WNW、WAD、WN对氧化损伤细胞的影响

蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD和WN对H2O2诱导氧化损伤的HEK293细胞具有保护作用（图3）。结果表明，H2O2处理的损伤组细胞相对存活率为（49.8±2.0）%，用不同浓度的肽处理氧化损伤的HEK293细胞后，细胞相对存活率均有所提高。浓度为1 μmol/L的WNWAD、WNW、WAD、WN处理细胞后相对存活率分别提高至（96.120±0.059）%、（63.300±0.019）%、（59.580±0.047）%、（74.550±0.024）%。随着肽浓度的升高，细胞相对存活率随之提高，WNWAD活性最强。蛋清肽WNWAD在浓度为40 μmol/L时，细胞相对存活率已经恢复到100%。芳香族氨基酸Trp、Tyr可通过供氢发挥抗氧化作用[17]，Saito等[20]发现在C端含有Trp和Tyr的三肽具有很强的自由基清除能力。而本实验中活性肽WNWAD、WN、WNW、WAD具有抗氧化能力可能也是N端的氨基酸Trp发挥的自由基清除能力。

图3 蛋清源肽对H2O2诱导损伤HEK293细胞的保护作用Fig. 3 Protective effect of peptides from egg white proteins on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

2.3.2 较低浓度WNWAD对氧化损伤细胞的影响

图 4 WNWAD对H2O2氧化损伤的HEK293细胞的保护作用Fig. 4 Protective effect of WNWAD on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

从2.3.1节实验结果可看出，WNWAD的抗氧化性较其他4 条肽强，在较低浓度时细胞相对存活率已经达到95%以上。浓度为1.0 μmol/L的WNWAD处理H2O2氧化损伤的细胞后，细胞相对存活率达到（96.120±0.059）%，其氧化应激抑制作用极强。因此考察了较低浓度的WNWAD对氧化损伤细胞的保护作用。随着活性肽浓度的增大，细胞存活率有一定幅度的增加但增速不明显（图4），综合考虑选用1.0 μmol/L的WNWAD进行后续实验。

2.4 WNWAD对细胞内GSSG浓度的影响

袁平戈等[21]研究表明GSH是细胞内的天然抗氧化剂，主要完成氧自由基的清除，在氧化应激状态下其自身被氧化成GSSG。有文献报道长时间力竭运动促使肝脏活性氧产生增加，导致GSH氧化为GSSG，GSH含量减少，GSSG含量增加，虽然当GSSG累积时，肝脏可将GSSG排入胆管，但最终GSH/GSSG的比值仍下降[22]。H2O2刺激细胞产生活性氧从而引起细胞的氧化应激，抗氧化成分的存在可有效消除H2O2刺激机体产生的氧自由基，降低GSSG含量，保持GSH/GSSG比值的稳定[22-23]。

图 5 WNWAD对HEK293细胞内GSSG浓度的影响Fig. 5 Effect of WNWAD on the content of GSSG in HEK293 cells

如图5所示，对照组的细胞中GSSG浓度为0.90 μmol/L，而损伤组则显著升高为33.23 μmol/L，不同浓度的WNWAD处理细胞后，细胞内GSSG浓度明显降低，其中0.5 μmol/L的WNWAD作用下GSSG浓度为0.96 μmol/L，接近于对照组细胞内GSSG浓度。但是，WNWAD浓度从0.5 μmol/L上升至10 μmol/L时，GSSG浓度有小幅提高，此现象出现原因需要进一步的实验研究。可见低浓度的WNWAD可以较大程度地减少细胞内GSSG的产生，其氧化应激抑制作用较强。GSSG浓度过高或GSH/GSSG比值不稳定可能导致蛋白质构型错误，从而影响细胞的正常生理代谢，WNWAD可以一定程度通过降低体内GSSG浓度的升高，维持GSH/GSSG比值的稳定与平衡来减小蛋白质折叠错误的机率而保护机体。

2.5 WNWAD对细胞内IL-8质量浓度的影响

IL-8是由Yoshimura等[24]首先发现的具有趋化功能的细胞因子。由于IL-8对于白细胞有趋化作用，所以在很多感染性疾病过程中其含量就会升高，IL-8水平与心血管疾病、肝脏疾病、呼吸道疾病等疾病有关，人外周血、尿液或细胞培养上清液中IL-8水平可作为炎性疾病的临床指标[25]。IL-8是生物作用非常强的炎症因子，如吸引白细胞到炎症局部、活化淋巴细胞、刺激其他细胞因子的产生及促进角朊细胞增殖等[26]。

如图6所示，对照组细胞中IL-8质量浓度为0.16 μg/L，经过H2O2处理过的HEK293细胞其上清液中IL-8质量浓度显著升高，加入WNWAD后，细胞中IL-8质量浓度又恢复到正常水平，与损伤组相比，WNWAD可显著降低细胞中的IL-8质量浓度。有研究表明IL-8与人体内白细胞的下降是同步的[27]。IL-8在恶性肿瘤中表达量高，与肿瘤的发生和发展也关系密切，所以，WNWAD对于IL-8的表达有一定的抑制作用，进而可能抑制炎症及肿瘤的发生发展，为缓解病情提供帮助。

图 6 WNWAD对细胞内IL-8质量浓度的影响Fig. 6 Effect of WNWAD on IL-8 level in HEK293 cells

2.6 WNWAD对细胞内TNF-α质量浓度的影响

TNF-α与炎症反应有关，而炎症反应与氧化应激又有密切的关系，TNF-α可直接诱导ROS的产生，造成细胞氧化损伤的进一步加重，促使细胞坏死凋亡[28-29]。炎症疾病中，TNF-α主要来源于单核巨噬细胞，同时淋巴细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、肥大细胞、内皮细胞、表皮细胞和成骨细胞等也能产生和释放TNF-α[30]。

图 7 WNWAD对细胞内TNF-α质量浓度的影响Fig. 7 Effect of WNWAD on TNF-α level in HEK293 cells

由图7可知，H2O2诱导损伤的细胞中TNF-α质量浓度大幅增加，达到0.406 μg/L，1 μmol/L WNWAD保护的细胞可有效地降低TNF-α的质量浓度，TNF-α表达水平变化可最先反映胰腺受损，TNF-α质量浓度的上升又促进IL-8质量浓度的升高，IL-8质量浓度与胰腺功能受损的情况成正比[31]，WNWAD可抑制TNF-α因子的释放，减弱炎症反应，可能减少胰腺的损伤。

3 结 论

氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡而导致产生了大量的中间氧化产物，即产生了过多的自由基。在对蛋清源肽WNWAD、WNW、WAD、WN、AD的氧化应激抑制作用研究中，发现除了肽AD外，WNWAD、WNW、WAD、WN 4 条肽在体外化学水平及细胞水平均表现出优良的抗氧化活性，其中WNWAD氧化应激抑制作用最强，在较低浓度时（1 μmol/L），WNWAD对H2O2诱导的氧化损伤细胞表现出很强的保护作用。并且WNWAD可明显降低细胞中GSSG浓度，维持GSH/GSSG比值的平衡与稳定，可有效抑制IL-8和TNF-α的释放。以上研究结果显示蛋清源活性肽对降低HEK293细胞氧化应激水平和提高细胞抗氧化能力、抗炎能力等有重要作用，其具体的抑制机理有待进一步探究。