腐败希瓦氏菌和荧光假单胞菌对冷藏凡纳滨对虾虾汁品质的影响

谢 晶，叶晶鑫，杨胜平，程 颖，林祖权，钱韻芳

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又称南美白对虾，是一种高品质经济养殖虾类品种，其养殖产量和销售量在全球许多地区持续增加，特别是在中国和马来西亚等地区[1-2]。但凡纳滨对虾丰富的营养价值，尤其是较高含量的蛋白质，使其在贮藏中极易被微生物分解，降低其营养价值[3-5]。冷藏是延长食品货架期最常用的方法，但是仍然有部分微生物能在低温下生长，即特定腐败菌[6-7]，是少数几种能够在一定条件下生长繁殖成为优势菌群并代谢产生腐败产物，最终导致食品腐败变质的微生物。水产品中常见的腐败菌有希瓦氏菌、假单胞菌、气单胞菌和不动杆菌等。但是水产品中腐败菌的种类和比例受品种、捕获季节、贮藏环境等因素的影响而有较大的差异[8]。前期研究发现冷藏凡纳滨对虾中的特定腐败菌是腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），它们都是革兰氏阴性菌，有嗜冷性。S. putrefaciens可以产生大量的三甲胺和腐败挥发性物质，而P. fluorescens降解蛋白质的能力强[9-10]。近年来，关于单一腐败菌的致腐败能力的研究比较多，但是在冷藏条件下微生物的生长和对食品致腐败能力与微生物之间的相互作用息息相关。Mejlholm等[11]在冷藏条件下将肉毒杆菌（Carnobacterium maltaromaticum）和热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）混合接种至对虾上，发现一些挥发性腐败异味只出现在混合接菌组中，Laursen等[12]进一步研究发现是这两种菌形成的代谢产物之间的相互作用产生了这种特殊的腐败异味。因此需要进一步研究微生物之间的相互作用对食品腐败产生的影响，而且目前关于S. putrefaciens和P. fluorescens的相互作用对凡纳滨对虾的致腐败作用的研究较少。

为研究凡纳滨对虾特定腐败菌和特定腐败菌在低温贮藏下的相互影响，本实验将S. putrefaciens和P. fluorescens接种到无菌虾汁中，以便为开发新型凡纳滨对虾等水产品的保鲜技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凡纳滨对虾购于上海市浦东新区古棕路农工商超市，充氧保活运至实验室。立即用碎冰猝死，去头、去尾、去壳、去肠腺、清洗，用于制备无菌虾汁。

铁琼脂培养基、假单胞菌选择性培养基、脑心浸肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司；轻质氧化镁、硼酸、盐酸、柠檬酸钠、高氯酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、丹酰氯、浓氨水、乙腈等 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TDL-5-型低速离心机 上海隆拓仪器设备有限公司；HVE-50灭菌锅 日本Hirayama制造有限公司；VS-1300L-U超净工作台 上海康福特环境科技有限公司；THZ-100恒温培养摇床 上海圣科仪器设备有限公司；DHP-9162低温培养箱 日本三洋电器集团有限公司；Kjeltec2300凯氏定氮仪 丹麦Foss公司；835氨基酸分析仪 日本日立公司；2695高效液相色谱系统、2996二极管阵列检测器及Empower色谱管理软件 美国Waters有限公司；PowerPac HV Power Supply蛋白电泳分析仪美国Bio-Rad生命医学产品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 前处理

1.3.1.1 S. putrefaciens和P. fluorescens菌悬液的制备

参照Parlapani等[13]的方法略有修改：取1 mL冻存的S. putrefaciens菌液于灭菌的9 mL脑心浸肉汤中活化18 h后，再取1 mL菌液接种于9 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中活化，培养8 h左右使菌液浓度达1.0×108CFU/mL后，用于无菌虾汁的接种。P. fluorescens菌悬液的制备方法同S. putrefaciens。

1.3.1.2 无菌虾汁的制备

参考Fall等[14]的方法制备无菌虾汁：鲜活凡纳滨对虾→去头、去尾、去壳、去肠腺、清洗→添加2 倍虾肉的蒸馏水后用榨汁机搅碎→100 ℃水浴锅中加热4 min→冷却后用纱布过滤虾汁→分装（100 mL/瓶）→添加2.00 g NaCl/瓶→高压灭菌锅121 ℃下灭菌30 min备用

1.3.1.3 接种与贮藏

将灭菌好的虾汁冷却至室温，随机分为4 组，其中接菌组每个锥形瓶中分别加入500 μL S. putrefaciens（S组）或P. fluorescens（P组）菌液，混合接菌组（SP组）分别吸取250 μL两种菌液加入虾汁中。以不接菌的虾汁为对照组（CK组），然后置于4 ℃恒温箱中贮藏8 d。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 微生物指标的测定

参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[15]中的平板计数法测定。用铁琼脂、假单胞菌选择性培养基分别测单独接菌组和混合接菌组中S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落数，用铁琼脂选择性培养基测不接菌的虾汁（CK组）的菌落数。

1.3.2.2 TVB-N含量的测定

参照Dabadé等[16]的方法测定凡纳滨对虾中的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，每组样品做2 个平行，取平均值。取3.00 mL虾汁，加入少量的蒸馏水，采用半微量凯氏定氮法进行测定。

1.3.2.3 氨基酸含量的测定

氨基酸含量的测定采用GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[17]所规定的方法。取200 μL虾汁放入水解管中水解，再取1.00 mL过0.22 μm滤膜进样，氨基酸分析仪测定，每组样品做2 个平行。

1.3.2.4 腐胺含量的测定

凡纳滨对虾中生物胺的提取参照Ikonić[18]、Eerola[19]等的方法，然后参照Fan Hongbin等[20]的方法使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行鉴定并定量分析生物胺含量，每组样品做3 次平行。

1.3.2.5 虾汁肌浆蛋白SDS-PAGE分析

参考Ramírez-Guerra等[21]的方法提取虾肉中肌浆蛋白。取虾汁40 μL，加入100 μL磷酸盐缓冲液A（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4、pI 0.05、pH 7.5）稀释。

参考Qian Yunfang等[1]的方法将样品与上样缓冲液（2.0 mL 0.5 mol/L Tris-HCl溶液（pH6.8）、4.0 mL 10 g/100 mL十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2.0 mL甘油、0.2 mL 1 g/100 mL溴酚蓝、1.8 mL蒸馏水）按体积比1∶1比例混合，在90 ℃条件下加热9 min；上样至12%的预制胶中并在150 V下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）。电泳完成后经考马斯亮蓝R250染色后洗脱并分析。

1.3.2.6 电子鼻检测

参考顾赛麒等[22]的方法将新鲜样品以及贮藏8 d的CK（CK8）、S（S8）、P（P8）、SP（SP8）5 组样品（每组4 次平行）进行电子鼻检测。各组于50 ℃平衡400 s后，以洁净的干燥空气为载气，流速150 mL/min，延滞时间10 min。通过电子鼻Winmuster分析软件对采集到的数据进行分析。

1.4 数据处理

利用Origin 8.6软件绘制曲线；采用SPSS 19软件进行ANOVA差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理对凡纳滨对虾虾汁中菌落数的影响

图1 接菌虾汁在4 ℃贮藏7 d菌落数的变化Fig. 1 Synergistic growth of S. putrefaciens and P. fluorescens in shrimp juice during storage at 4 ℃ for 7 days

图1 为在4 ℃条件下的凡纳滨对虾虾汁中S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落数变化趋势图。初始接菌量约为5.30（lg（CFU/mL））。从图1中可以看出，单独接种S. putrefaciens的菌落数始终高于P组，且呈现显著差异（P＜0.05），从2 d开始，单独接种S. putrefaciens的菌落数就已经达到7.08（lg（CFU/mL）），说明在4 ℃冷藏凡纳滨对虾虾汁中S. putrefaciens的生长繁殖能力高于P. fluorescens，与前期研究发现冷藏凡纳滨对虾菌群中S. putrefaciens的相对丰度高于P. fluorescens[23]相一致。SP组中的S. putrefaciens和P. fluorescens的菌落数在贮藏7 d后分别达到8.85（lg（CFU/mL））和8.26（lg（CFU/mL）），都显著高于单独接菌组（P＜0.05），表明这两种微生物存在相互促进作用。Joffraud等[24]研究发现发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）和弧菌（Vibrio sp.）可以缩短栖鱼肉食杆菌（Carnobacterium piscicola）的延滞期，Laursen等[12]发现肉食杆菌（Carnobacterium maltaromaticum）可以促进热死环丝菌（Brochothrix thermosphacta）的生长。

2.2 不同处理对凡纳滨对虾虾汁中TVB-N含量的影响

图2 接菌虾汁在4 ℃贮藏中TVB-N含量的变化Fig. 2 TVB-N contents of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

在微生物和酶的共同作用下，水产品中含量较高的蛋白质被分解而产生的氨以及胺类等含氮物质统称为TVB-N[25]。TVB-N是评判水产品的鲜度和微生物引起水产品腐败程度的重要指标[26]，由图2可知，3 组接菌组的TVB-N含量上升较快，与CK组有显著性差异，表明接菌组TVB-N含量的上升与其接种的微生物生长代谢活动有关，CK组因经过高温灭菌微生物数量较少，因此TVB-N含量上升缓慢。在接菌的初期TVB-N含量升高缓慢，2 d后迅速上升，说明微生物数量达到一定数量后，腐败产物才会进入快速形成阶段。P组的TVB-N含量较S组低，说明S. putrefaciens对凡纳滨对虾的致腐败能力比P. fluorescens强，这与图1中菌落数的变化一致。SP组的TVB-N含量在贮藏7 d后达到16.19 mg/100 mL，较单独接菌组高，说明这两种腐败菌具有协同作用，其致腐败能力高于单独接菌组；这可能是因为这两种腐败菌可分泌促进双方生长的信号分子[27]。

2.3 不同处理对凡纳滨对虾虾汁中氨基酸含量的影响

表1 接菌虾汁在4 ℃贮藏8 d后氨基酸含量的变化Table1 Total amino acid contents of uninoculated and inoculated Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃ for 8 days mg/g

有机体蛋白质组织的基本成分是氨基酸，其在生物体的生命活动中发挥着非常重要的作用[28-29]。从表1中可以看出，与新鲜样品对比，贮藏终点的接菌组中各种氨基酸的含量降低。贮藏8 d后，S组中Asp、Ala、Leu和His等各氨基酸和总氨基酸的含量均低于P组，但高于SP组，说明在4 ℃贮藏中S. putrefaciens的氨基酸降解能力高于P. fluorescens，而二者可协同加速氨基酸的降解。

2.4 不同处理对凡纳滨对虾虾汁中生物胺含量的影响

图3 接菌虾汁在4 ℃贮藏中腐胺含量的变化Fig. 3 Putrescine contents of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

S. putrefaciens和P. fluorescens可以使高蛋白水产品中鸟氨酸、赖氨酸和组氨酸发生脱羧作用生成腐胺、尸胺和少量组胺，随着贮藏时间的延长，微生物产生的生物胺的含量升高，有害物质积累，水产品的新鲜程度逐渐降低。腐胺是凡纳滨对虾腐败过程中最主要的生物胺[30-31]。从图3可看出，CK组的腐胺含量几乎没有上升，而且在任何时间段，S组的腐胺含量都比P组高，说明在4 ℃贮藏下S. putrefaciens的致腐败能力强于P. fluorescens。SP组在2 d后腐胺含量迅速上升，高于单独接菌组，在4 d时SP组的腐胺含量为50.43 mg/100 mL，比S组的含量高45.46%；说明S. putrefaciens和P. fluorescens在虾汁中的协同作用会促进微生物代谢产生脱羧酶，形成生物胺，提高对凡纳滨对虾的致腐败能力。在4～6 d时，3 个接菌组的腐胺含量略有下降，这可能是因为低温环境下微生物进入稳定期后，代谢活性降低，同时腐胺也有可能被分解，这与孙亚军[32]的研究结果一致。

2.5 不同处理对凡纳滨对虾虾汁中肌浆蛋白的影响

图4 接菌虾汁在4 ℃贮藏中肌浆蛋白的变化Fig. 4 SDS-PAGE pattern of myogens in Pacific white shrimp during storage at 4 ℃

图4 是通过SDS-PAGE法分析了4 ℃贮藏3 d和7 d时，3 种接菌方式对凡纳滨对虾肌浆蛋白的影响。可以看出，凡纳滨对虾虾汁在4 ℃贮藏3 d和7 d后，相比于S组和P组，SP组的蛋白条带Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的灰度略有降低，说明混合接菌处理加速了对肌浆蛋白的降解，对凡纳滨对虾虾汁的致腐败能力较强。

2.6 不同处理对凡纳滨对虾虾汁中挥发性气味的影响

图5 接菌虾汁在4 ℃贮藏中香气轮廓PCA图Fig. 5 PCA chart for aroma profiles of Pacific white shrimp juice during storage at 4 ℃

主成分分析（principal component analysis，PCA）可以根据不同接菌组产生的挥发性物质的相似性和差异性将复杂的信息更加直观地展现出来[33-34]。食品中微生物的迅速繁殖导致了腐败代谢产物的产生，包括感官不可接受的腐败挥发性物质。由图5可知，各组数据采集点所在的区域无重叠，说明主成分分析法适用于不同接菌组中挥发性物质的分析。第一主成分的贡献率为97.43%，第二主成分的贡献率为1.62%，两者的总贡献率为99.05%，说明所受干扰较小，可以将不同接菌组的腐败情况完全区分开。贮藏8 d后的CK组和P组，与贮藏8 d后的SP组和S组在PC1轴差异较大，表明电子鼻区分以上组别主要是第一主成分起作用。接菌组中与新鲜样品差异最大的是贮藏8 d的S组，其次是SP组，与新鲜样品差异最小的单独接种组是P. fluorescens组，说明S. putrefaciens在4 ℃贮藏8 d后产生的腐败挥发性物质的能力最强，在S. putrefaciens存在的条件下可以加速P. fluorescens产生腐败代谢产物，提高其腐败活性，与Mejlholm等[11]的研究结果一致。两种菌在混合培养的条件下才会产生某种腐败挥发性物质，可能是这两种菌形成的代谢产物之间的相互作用所致[12]。

3 结 论

本实验主要研究了凡纳滨对虾中的主要腐败微生物S. putrefaciens和P. fluorescens之间的相互作用。通过菌落数分析发现S. putrefaciens比P. fluorescens更适应于在4 ℃的虾汁中生长。相比于单独接菌组，混合接菌组中的TVB-N含量和腐胺含量更高，说明两种菌混合培养能相互提高彼此的致腐败能力。本研究有助于加深对水产品复杂菌群体系中微生物相互作用方式的了解，为开发新型凡纳滨对虾等水产品的保鲜技术提供了一定的理论依据。