锌指蛋白PRDM16在肥胖大鼠睾丸及睾周脂肪中的相关性研究

齐亚楠，刘文娇，梅雪昂，马婧，韩瑞钰，马姣英，王树松，，*

(1.河北医科大学研究生学院，石家庄 050017；2.河北师范大学化学与材料科学学院，石家庄 050024；3.河北省计划生育科学技术研究院/国家卫生和计划生育委员会计划生育与优生重点实验室，石家庄 050071)

肥胖已经成为一个全球性的问题。有研究显示，我国35～64岁人群肥胖率高达20.2%，超重率更是超过了38.8%[1]。哺乳动物体内脂肪根据功能可分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织，两者在肥胖发生机制中的作用恰好相反。因此，脂肪细胞分化调控机制一直是肥胖领域研究的热点。PRDM蛋白家族是一类具有锌指结构的蛋白转录因子，目前在人体组织和细胞中共发现了17种[2]。有研究显示，PRDM16在棕色脂肪形成过程中起到分子开关的作用，可通过诱导棕色脂肪形成过程中基因的表达，增强线粒体解偶联呼吸作用，使机体多余的能量以热能的形式散发，从而抑制肥胖[3-4]。目前，精液常规分析仍然是衡量男性生育力和精子质量的主要指标[5]，因此我们同时对大鼠精液参数进行了分析。本课题组通过前期研究发现，锌相关蛋白与男性生殖密切相关(待发表)，而PRDM16又是与肥胖相关的锌指蛋白，因此本研究构建了肥胖大鼠模型，通过免疫组织化学、实时荧光定量PCR和免疫印迹试验(Western Blot)技术检测锌指蛋白PRDM16在大鼠睾丸、睾周脂肪中的表达及在睾丸中的定位，探讨锌指蛋白PRDM16、肥胖和生殖的关系。

材料与方法

一、实验动物

1.实验动物及肥胖动物模型的建立：清洁级雄性SD大鼠20只，平均体重为(103±11)g，购买于河北医科大学动物实验中心。实验大鼠适应性喂养一周后，将20只SD大鼠随机分成正常组6只和肥胖组14只；其中正常组给予普通饲料喂养，肥胖组给予高脂饲料喂养。期间自由进食水，标准鼠笼喂养，每笼3只，饲养温度为20～25℃，每周对大鼠体重进行检测。12周末，肥胖组大鼠体质量大于正常组平均体质量的20%为肥胖模型构建成功。最终成功建立肥胖大鼠模型7只。

2.样品的制备：采用10%的水合氯醛溶液对大鼠进行腹腔麻醉，取大鼠睾丸组织和双侧睾周脂肪称重并记录，部分睾丸组织放入10%的甲醛溶液中固定，其余立即放入液氮中，最终放置-80℃保存待用。

二、方法

1.HE染色：10%的甲醛固定不同组大鼠睾丸组织，石蜡包埋，切片烤片，常规脱蜡复水；苏木素染色2 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化3 s，自来水冲洗后氨水返蓝3 s，自来水冲洗，伊红染色30 s；自来水冲洗后梯度酒精脱水，中性树胶封片。

2.免疫组织化学：10%的甲醛固定不同组大鼠睾丸组织，石蜡包埋，切片烤片，脱蜡复水；PBS洗涤3次，枸橼酸钠抗原修复，室温自然冷却，洗涤后用3%的过氧化氢孵育40 min；PBS洗涤3次，山羊血清封闭1 h，滴加抗体PRDM16(PA5-20872，Thermo Fisher，美国)，其中一抗用PBS以1∶100的比例稀释，4℃过夜；PBS洗涤3次，滴加生物素标记山羊抗兔IgG工作液(SP-9001，北京中杉金桥)室温孵育1 h；洗涤后加辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育30 min，PBS洗涤3次，DAB(北京中杉金桥)显色，苏木素复染、中性树胶封片。阳性染色为棕黄色。

3.实时荧光定量PCR：称取不同组大鼠睾丸、睾周脂肪于无酶微量离心管(EP)管中，用动物组织总RNA提取试剂盒(ZP404，北京庄盟国际)提取睾丸及睾周脂肪组织总RNA，并按照说明书逆转为cDNA，并以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增PRDM16。

PRDM16引物序列：F 5’-CACAACTTGCTGGTCAAGGC-3’，R 5’-GCAGGTTTGGCCTCTTTTGG-3’；

β-actin引物序列：F 5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，R 5’-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3’。

PCR反应条件如下：94℃预变性3 min；94℃15 s、63.2℃30 s、72℃30 s，共35个循环；最后72℃延伸5 min。以β-actin基因作为内参。

分别以正常组大鼠睾丸及睾周脂肪组织为代表1倍目的基因表达量的校准样品，以2-△△CT法计算肥胖组大鼠睾丸及睾周脂肪中的相对表达量。

4.Western Blot：称取不同组大鼠睾丸组织及睾周脂肪于微量离心管(EP)管中，500 ml裂解液+5 μl PSMF充分剪碎并超声裂解5 min，离心取上清，用BCA试剂盒(PQ0012，杭州联科生物)测蛋白浓度，并计算蛋白上样量；按SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(ZD304A，北京庄盟国际)说明书，PRDM16配制8%的分离胶，内参β-actin配制10%分离胶，浓缩胶为5%，浓缩胶恒压为80 V，分离胶恒压120 V，200 mA，1.5 h转膜到硝酸纤维素膜上；5%的脱脂奶粉封闭1.5 h，一抗PRDM16(PA5-20872，Thermo Fisher，美国)以1∶1 000稀释，内参β-actin(ARH4149，Antibody Revolution，美国)以1∶2 000稀释，4℃孵育过夜；再将标记HPR的羊抗兔二抗(D110058，BBI Life Sciences，美国)用5%脱脂奶粉以1∶8 000稀释，室温孵育1.5 h，ECL化学发光试剂盒(ZD310A，北京庄盟国际)显影。采用Image J2X软件分析样品目的条带和相应内参条带的灰度值，样本PRDM16蛋白的相对表达量以目的条带与内参条带灰度值的比值表示，分析不同组睾丸及睾周脂肪中PRDM16蛋白表达情况。

5.大鼠精液参数分析：取新鲜大鼠附睾尾部，在生理盐水中剪碎，充分混匀后，取10 μl混合液加入精子计数板中，记录精子浓度和精子活力。

三、统计学分析

采用SPSS 21.0软件对实验数据进行分析。两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组大鼠体重、睾丸及睾周脂肪结果

与正常组相比，肥胖组大鼠体重和睾周脂肪质量均显著增加，而睾丸/体重比值显著降低(P<0.05)；肥胖组与正常组大鼠睾丸质量无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 正常组和肥胖组大鼠体重、睾丸和睾周脂肪比较(-±s)

注：与正常组比较，*P<0.05

二、两组大鼠精液参数分析

对正常组和肥胖组大鼠精液分析发现，肥胖组大鼠精子浓度和活力显著低于正常组(P<0.05)(表2)。

表2 正常组和肥胖组大鼠精液参数分析(-±s)

注：与正常组比较，*P<0.05

三、两组大鼠睾丸组织学及PRDM16在睾丸组织中的定位

HE染色显示，正常组大鼠睾丸生精小管由多层不同发育阶段的生精细胞组成，生精小管排列整齐，管腔内各级生精细胞结构正常，层次清楚，可见大量精子(图1A、C)；而肥胖组大鼠生精小管排列疏松，间质变宽，睾丸生精上皮结构不完整，生精细胞层数减少，并出现空泡样改变，管腔内精子数量减少(图1B、D)。

免疫组织化学染色显示，锌指蛋白PRDM16主要表达于大鼠睾丸生精细胞胞质中，且肥胖组大鼠睾丸PRDM16的表达量较正常组明显减少(图2)。

A：正常组(×40)；B：肥胖组(×40)；C：正常组(×100)；D：肥胖组(×100)图1 正常组和肥胖组大鼠睾丸组织(HE染色)

A：正常组；B：肥胖组图2 正常组和肥胖组大鼠睾丸组织PRDM16表达(免疫组织化学染色 ×100)

四、PRDM16 mRNA在两组大鼠睾丸、睾周脂肪中的表达

实时荧光定量PCR显示，肥胖组大鼠睾丸及睾周脂肪组织中PRDM16 mRNA的表达量均显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。五、PRDM16蛋白在两组大鼠睾丸及睾周脂肪组织中的表达Western Blot结果发现，肥胖组大鼠睾丸及睾周脂肪中PRDM16蛋白表达量均显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

与正常组比较，*P<0.05图3 正常组和肥胖组大鼠睾丸及睾周脂肪组织PRDM16 mRNA的表达

讨 论

锌指蛋白是一类通过结合Zn2+自我折叠形成短的稳定的“手指”样结构的蛋白质。锌指蛋白在基因表达调控、细胞分化和生殖等方面发挥着重要的作用[6]。PRDM蛋白家族属于锌指蛋白家族，其中的锌指结构域具有识别DNA、RNA和募集组蛋白修饰酶的作用。PRDM蛋白家族属于Ca2+依赖磷脂结合蛋白，在许多生理和病理性疾病中发挥着重要的作用[2]。锌指蛋白PRDM16最早被发现是在研究白血病的过程中，后发现广泛存在于机体多种组织和器官[7]。锌指蛋白PRDM16可通过催化H3K9mel来维持哺乳动物异染色体的稳定性。大量研究证实，PRDM16与脂肪细胞、干细胞的分化密切相关[2，4]。有研究发现，前列腺癌细胞中PRDM16具有抗凋亡的作用[8]；在造血和神经系统中，PRDM16可影响细胞周期、分化和凋亡，PRDM16基因缺陷的小鼠体内可出现P53蛋白和活性氧(ROS)的表达量增加，维持干细胞功能的基因Hgf mRNA的表达量降低[9-10]，高脂饮食的肥胖大鼠PRDM16基因突变，可使内脏脂肪组织产热减少，炎性因子基因的表达增加，且出现巨噬细胞聚集[3]。本课题组研究发现，PRDM16在睾丸各级生精细胞胞质中表达，推测PRDM16可能与精子的生成相关，但有待于进一步的研究。

肥胖是由于过多的脂肪组织在体内蓄积或分布不合理引起的，但是机体内的脂肪组织并非都是有害的。白色脂肪组织通常由白色脂肪细胞聚集而成，可以将体内过多的能量以甘油三酯形式储存起来；而棕色脂肪组织中含有丰富的线粒体，可以将体内过多的能量通过解偶联途径以热能的形式释放，具有抵抗肥胖的作用[4，11]。PRDM16不仅为棕色脂肪组织分化的关键基因，也是产热程序启动的开关基因[12-13]。在含有丰富棕色脂肪组织的啮齿类动物中，均发现肥胖动物模型出现棕色脂肪产热作用的缺陷[14]。本研究发现，肥胖大鼠睾周脂肪含量明显高于正常组，而锌指蛋白PRDM16的表达量却显著低于正常组。睾周脂肪属于内脏白色脂肪，米色脂肪是一类存在于白色脂肪中，但形态和功能介于白色脂肪和棕色脂肪之间的脂肪。米色脂肪在一定的刺激下，可以发生类似于棕色脂肪的生化特性和产热潜能，被称为“白色脂肪棕色化”，而PRDM16又是白色脂肪棕色化的重要调控因子[15-16]，睾周脂肪中PRDM16的表达量降低，可以抑制白色脂肪棕色化，进一步促进肥胖的发生。

肥胖对生育力有着负面的影响。本研究成功构建肥胖大鼠模型，通过精液分析发现：与正常组大鼠相比，肥胖组大鼠精子浓度显著降低；HE染色发现，肥胖组大鼠睾丸生精上皮细胞结构不完整，生精小管内出现空泡样改变，影响精子形成，导致精子浓度降低。本课题组前期研究也发现，肥胖可影响机体氧化应激水平和精浆中炎性因子含量(待发表)。过高的活性氧可以损害精子细胞膜，促进精子凋亡；炎性因子改变可影响精子生成的微环境，从而影响精液质量[17-18]。

综上所述，肥胖大鼠睾丸及睾周脂肪中PRDM16的表达量、精子浓度和精子活力与正常组相比均显著降低，锌指蛋白PRDM16在大鼠睾丸生精细胞胞质中表达，推测其与雄性生殖有关，但有待于进一步的研究证实。