不同中药对脂多糖刺激RIMVECs后PMNs杀菌酶释放及内源性 抗菌肽表达的影响

高洋　朱雯雨　穆祥

摘要：为比较黄连、白头翁、秦皮、黄柏和马齿苋对脂多糖（LPS）刺激大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMVECs）后中性粒细胞（PMNs）释放杀菌酶及内源性抗菌肽（rCRAMP）表达的影响。建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell体系，试验分为LPS对照组、LPS+黄连组、LPS+黄柏组、LPS+白头翁组、LPS+秦皮组和LPS+马齿苋组，运用ELISA和Western Blotting（WB）较全面系统地研究了以上5种中药对LPS刺激RIMVECs后PMNs杀菌酶释放及rCRAMP表达的变化。当LPS刺激RIMVECs后，与LPS对照组相比，LPS+黄连和LPS+白头翁组PMNs弹性蛋白酶（NE）分泌量显著增加；LPS+黄连和LPS+白头翁组PMNs组织蛋白酶（CG）分泌量明显增加，LPS+黄连和LPS+白头翁组PMNs溶菌酶（LYS）分泌量极显著增加，LPS+黄连组rCRAMP相对表达量显著升高。结果表明，黄连和白头翁明显促进LPS刺激RIMVECs后PMNs释放杀菌酶和表达rCRAMP，对机体起保护作用。

关键词：中药；脂多糖（LPS）；杀菌酶；内源性抗菌肽（rCRAMP）

中图分类号：S853.74 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）05-0005-03

近年来，随着中药国际化进程的加快，中药对于某些疾病良好的治疗效果得到国际上广泛认可，并且在欧美国家出现“中药热”现象。有研究发现，龙芩草因含黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸等对H1N1流感病毒有一定的抵抗作用[1]；黃连、黄柏、白头翁、秦皮及马齿苋等中药可提高机体细胞免疫功能并能促进多种细胞因子的分泌[2-6]，常用于治疗或辅助治疗感冒等疾病。中性粒细胞可分泌弹性蛋白酶（NE）和组织蛋白酶（CG）调控机体炎症反应[7，8]，溶菌酶（LYS）和内源性抗菌肽（rCRAMP）是天然的具有抗菌活性的蛋白质，中性粒细胞（PMNs）分泌LYS和rCRAMP是其能够杀灭细菌的原因之一[9，10]。由于黄连、黄柏、白头翁、秦皮及马齿苋5味中药对PMNs作用的影响未见详细报道，故为探究以上5味中药对脂多糖（LPS）刺激RIMVECs后PMNs释放杀菌酶和表达rCRAMP的影响，本研究以RIMVECs和PMNs为研究对象，在成功建立大鼠RIMVECs-PMNs的Transwell体系基础上，运用ELISA和Western Blotting（WB）试验方法，较系统地阐述以上5味中药对PMNs在炎症反应中的影响，为黄连、白头翁、秦皮等中药在兽医临床中应用以及作为饲料添加剂等提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司。rCRAMP抗体，OmnimAbs公司；NE、CG和LYS检测试剂盒，上海酶联生物技术有限公司；白头翁、黄连、黄柏、秦皮和马齿苋，北京同仁堂药店。

1.2 仪器设备

CO2培养箱，SANYO公司；电泳仪，BIO-RAD公司等。

1.3 方法

1.3.1 黄连、白头翁、黄柏、秦皮和马齿苋的煎制处理 取以上5种中药各50 g，分别放入药罐中，加10倍体积去离子水浸泡30 min。快火熬药，待水沸腾后，调慢火维持沸腾30 min，收集药液，使用200目筛趁热过滤。加入8倍体积去离子水煎煮1 h，收集药液，趁热过滤。加入4倍体积去离子水煮1 h，收集药液，趁热过滤。将3次收集的药液合并过滤，利用旋转蒸发仪，将5种中药水煎液的浓度浓缩至1 g/mL，于80 ℃真空干燥箱中干燥处理，冷却后密封，于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2 分组及处理 参考本实验室已建立的鼠RIMVECs-PMNs的Transwell体系[4]，利用Transwell通透性支持物进行试验。当体系中RIMVECs汇合至80%～90%时，用D-hanks清洗2次，将细胞分为6组，即LPS对照组（LPS+DMEM）、LPS+黄连组（LPS+HL）、LPS+黄柏组（LPS+HB）、LPS+白头翁组（LPS+BTW）、LPS+秦皮组（LPS+QP）、LPS+马齿苋组（LPS+MCX）。分别加入1.5 mL 10 μg/mL的LPS预处理4 h，药物组分别加入1.5 mL上述中药（200 μg/mL黄连、200 μg/mL黄柏、100 μg/mL白头翁、500 μg/mL秦皮和1 mg/mL马齿苋，通过预试验获得药物安全浓度），LPS对照组加无血清的DMEM培养液，药物组分别加入2.6 mL DMEM培养液，置于37 ℃的5%CO2中培养24 h。各组中加入提取好的PMNs（5×106个/mL），同时加入2.6 mL 2%1640培养基，孵育3 h后收集样品并标记。

1.3.3 对PMNs迁移RIMVECs后释放NE、CG和LYS的检测 将细胞上清液以3 000 r/m离心10 min去除颗粒物，依据试剂盒说明书操作步骤进行NE、CG和LYS检测，绘制标准曲线，计算NE、CG和LYS分泌量。

1.3.4 对PMNs迁移RIMVECs后rCRAMP的表达 提取细胞蛋白质，依据WB步骤检测rCRAMP表达量，以目的蛋白质与actin的灰度比值表示目的蛋白质相对表达量。

1.3.5 数据处理与分析 本试验数据使用Graphpad Prism5进行统计分析。数据以平均数±标准差（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，有统计学意义；P>0.05表示差异不显著，无统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同中药对跨内皮细胞PMNs分泌NE、CG的影响

当LPS刺激RIMVECs后，依据不同中药对RIMVECs迁移PMNs及正常未跨越RIMVECs的PMNs的NE和CG的分泌量绘制标准曲线（图1、图2），R2均大于0.95，根据试剂盒使用要求，绘制的标准曲线均可用。与LPS+DMEM组相比，LPS+HL和LPS+BTW组PMNs的NE分泌量显著增加（P<0.05）；与LPS+DMEM组相比，LPS+HL组PMNs的CG分泌量极显著增加（P<0.01），LPS+BTW组CG释放量显著增高（P<0.05），其余中药组没有显著变化（图3、图4）。

2.2 不同中药对跨内皮细胞PMNs分泌溶菌酶的影响

当LPS刺激RIMVECs后，测定不同中药对RIMVECs迁移PMNs及正常未跨越RIMVECs的LYS分泌量，并绘制标准曲线（图5），依据试剂盒使用要求R2大于0.95，即绘制的标准曲线可用。与LPS+DMEM组相比，LPS+HL和LPS+BTW组PMNs的LYS分泌量极显著增加（P<0.01）；LPS+HB和LPS+QP组PMNs的LYS分泌量增加，但差异不顯著（P>0.05）（图6）。

2.3 不同中药对PMNs跨内皮后rCRAMP表达的影响

当LPS刺激内皮细胞后，LPS+HL组rCRAMP的相对表达量显著升高（P<0.05），LPS+BTW和LPS+QP组rCRAMP的相对表达量也增加，但差异不显著（P>0.05）。结果显示在rCRAMP表达上，中药黄连的保护作用更明显（图7、图8）。

3 讨论

NE是由PMNs分泌的炎症介质，正常剂量NE可缓解感染对机体的损伤，但高剂量NE可降解胶原蛋白、层黏连蛋白以及细胞外基质，并通过EGFR、p38MAPK、ERK等信号通路调节黏液蛋白的分泌[7]。CG是由PMNs和单核细胞分泌产生的丝氨酸亚型组织蛋白酶，其通过水解活化细胞因子调控炎症。当LPS刺激RIMVECs后，与LPS+DMEM组相比，LPS+HL和LPS+BTW组PMNs的NE分泌量显著增加（P<0.05）；与LPS+DMEM相比，LPS+HL和，LPS+BTW组PMNs的CG分泌量极显著或显著增加（P<0.01，P<0.05），以上结果揭示黄连和白头翁通过修复RIMVECs后，使得PMNs被激活释放NE和CG，其作用机制可能为：黄连和黄柏含有丰富的黄连素、多糖等物质，而白头翁含白头翁素等有效成分，当LPS+黄连或白头翁等作用细胞后，黄连素和白头翁素可能与RIMVECs表面的受体相互作用进而激活胞内相关信号通路，被激活后的RIMVECs释放大量趋化因子，如IL-18、IL-1和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等，这些物质会刺激并激活PMNs，激活后的PMNs将胞内颗粒释放到胞外，后者含大量NE和CG，能够诱导炎症反应[7]。

LYS是一种天然抗菌蛋白，由PMNs等炎症细胞产生。主要针对革兰氏阳性菌有杀灭或抑制作用。rCRAMP是哺乳动物体内具有抗菌作用的小分子多肽类物质，不同物种间内源性抗菌肽具有功能上的高度保守，具有抑制细菌、真菌、病毒等作用，又能促进趋化因子释放，还可中和LPS并减轻内毒素性休克。rCRAMP是大鼠中惟一的内源性抗菌肽[9]，通过检测LYS分泌量和rCRAMP表达量可更好的评判PMNs跨内皮细胞后的抑菌或杀菌功能。当LPS刺激RIMVECs后，与LPS对照组相比，LPS+HL和LPS+BTW组PMNs的LYS分泌量极显著增加（P<0.01），LPS+HL组rCRAMP的相对表达量显著升高（P<0.05），结果显示，在rCRAMP表达水平上，黄连的抑菌杀菌作用最明显。PMNs膜表面的整合素蛋白与RIMVECs膜表面的ICAM受体蛋白结合后，PMNs形态发生变化而穿过RIMVECs，PMNs吞噬LPS而被激活，释放出LYS和rCRAMP，而黄连和白头翁等中药的有效成分进一步促进PMNs释放出LYS和rCRAMP，所以表现出LPS+HL或BTW组PMNs释放LYS和表达rCRAMP显著增加。

黄连、白头翁、黄柏、秦皮和马齿苋对LPS刺激RIMVECs后PMNs的NE、CG、LYS和rCRAMP表达均有不同程度的影响，其中黄连和白头翁的促进表达作用效果显著，说明以上两种中药可通过显著增加PMNs的溶菌酶释放和抗菌肽表达来提升保护效果，本研究为以上5种中药在兽医临床中的应用和作为饲料添加剂提供了理论依据。

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