大蒜素对慢性肾功能衰竭大鼠炎症反应及肾脏组织纤维化的影响

2018-07-16许宁宁

天津中医药 2018年7期

许宁宁

（张家口市第一医院，张家口　075000）

慢性肾功能衰竭（CRF）是多种慢性肾脏疾病导致肾功能减退，引发肾小球滤过率下降、毒素潴留、电解质代谢紊乱、酸碱失衡等，呈现全身多系统症状的一个临床综合征[1-2]，是各种肾脏疾病终末期的共同结局。既往研究发现，炎症反应及肾脏组织纤维化是导致肾结构破坏、功能减退甚至丧失的主要病理原因，是各种慢性肾病发展为CRF的共同通路[3]，因此抑制肾纤维化是延缓肾功能衰竭的有效途径，也是新药研发的重要思路。大蒜素是一种具有降血脂、改善血流动力学等药理学作用的二烯丙基三硫化物[4-5]，且叶静等[6]和曾玉兰等[7]研究发现大蒜素对肝组织纤维化和肺组织纤维化均具有一定的抑制作用，朱兰香等[8]研究发现大蒜素对肝组织纤维化后炎症研发具有抑制作用，但大蒜素对CRF后炎症反应和肾脏组织纤维化的影响相关文献报道尚不多见。本研究通过制备CRF大鼠模型，观察大蒜素对CRF大鼠炎症反应和肾脏组织纤维化的影响，探讨大蒜素对CRF大鼠的保护作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性清洁级SD大鼠，7周龄，200～240 g，河北省实验动物中心提供[SCXK（冀）：2013-1-003]。

1.2实验药物与试剂大蒜素注射液[黑龙江江世药业有限公司，2 mL（30 mg）]；H&E 试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、尿酸（UA）、尿蛋白（Pro）试剂盒（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；C-Ⅳ、PC-Ⅲ、层黏连蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）、C 反应蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（北京博奥森生物工程有限公司）；I型胶原（Col I）、纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）多克隆抗体SP试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；腺嘌呤（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3模型制备与分组参照文献方法制备CRF大鼠模型[9]：25%腺嘌呤溶液250 mg/（kg·d）连续灌胃21 d制备CRF大鼠模型，正常对照组正常饮食与饮水。80只模型大鼠随机分为模型组和大蒜素5、10、20 mg/（kg·d）组，每组20只，另设正常对照组（20只）。取大蒜素注射液并加适量生理盐水配置浓度为10、5、2.5 mg/mL大蒜素溶液，各组大鼠分别给药2 mL/kg，模型组和正常对照组分别给予等体积生理盐水2 mL/kg，疗程为28 d。

1.4实验方法

1.4.1血清指标检测腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉，开腹并经腹主动脉取血（不抗凝），离心取血清，分别按照试剂盒使用说明进行处理，然后通过生化分析仪测定血清 BUN、SCr、UA、Pro含量；参照各指标酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒操作说明，通过酶标仪检测血浆中CⅣ、PCⅢ、LN、HN水平；参照各指标ELISA检测试剂盒操作说明，通过酶标仪检测血清中CRP、IL-6、TNF-α含量水平。

1.4.2肾脏指数计算治疗完成后分别称鼠体质量，取双侧肾脏组织并称左侧肾质量，然后计算肾脏指数，肾脏指数=左侧肾脏质量/体质量。

1.4.3肾脏组织病变观察及病变评分取右侧肾脏组织，置于多聚甲醛溶液（浓度为4%）中固定72 h，依次进行石蜡包埋、切片（3 μm）和常规脱蜡水化处理，按照HE染色试剂盒说明进行处理，封片后通过显微镜观察肾脏组织病变并照相保存。肾脏组织病变评分：标准见表1。

表1　肾脏组织病变评分标准Tab.1　Criteria for classification of renal tissue lesions

1.4.4肾脏中Col I、PAI-1、MMP-1表达的测定取“1.4.3”制备的肾脏组织石蜡切片，经常规脱蜡水化处理后，采用SP法行免疫组织化学染色（IHC）观察Col I、PAI-1、MMP-1表达。染色图片均采用Motic Med 6.0病理图像分析系统进行分析，分别选取5个不同的视野测定光密度值（OD），以OD表示Col I、PAI-1、MMP-1表达。

1.5统计学方法实验数据运用SPSS 19.0进行数理统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，计量资料若呈正态分布，组间比较采用单因素方差分析；计量资料若呈偏态分布，组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清肾功能指标检测结果与正常对照组比较，CRF模型组大鼠血清BUN、SCr、UA及尿液Pro含量均升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）组能够显著降低CRF大鼠血清BUN、SCr、UA及尿液Pro含量（P＜0.05或 P＜0.01）。结果见表 2。

表2　各组大鼠血清肾功能及尿液Pro指标检测结果（x±s）Tab.2　The results of serum renal function in rats of each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）正常对照组　20　6.09±1.41　70.05±9.17模型组　20　24.07±3.82**　134.89±35.02**大蒜素5 mg/（kg·d）组2019.97±4.09125.90±36.82大蒜素10 mg/（kg·d）组2014.51±2.76##116.28±27.35#大蒜素20 mg/（kg·d）组2011.48±2.43##106.57±24.18#组别　动物数　UA（mmol/L）　Pro（mg/24 h）正常对照组　20　65.94±9.82　75.88±21.80模型组　20　114.76±16.53**　177.94±96.47**大蒜素5 mg/（kg·d）组2098.56±23.08169.81±98.85大蒜素10 mg/（kg·d）组2083.34±16.42##152.79±48.43#大蒜素20 mg/（kg·d）组2077.86±13.97##137.03±42.61##

2.2肾脏指数计算结果与正常对照组比较，CRF模型组大鼠体质量显著降低且肾脏指数均显著升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）组能够显著提高CRF大鼠体质量并降低肾脏指数（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表 3。

表3　各组大鼠体质量、肾脏指数计算结果（±s）Tab.3　The body weight and kidney index in rats of each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别　动物数　体质量（g）　肾脏指数（×10-3）正常对照组　20　311.27±33.53　3.82±0.61模型组　20　208.67±31.59**　17.03±2.05**大蒜素5 mg/（kg·d）组20216.04±28.5215.85±1.91大蒜素10 mg/（kg·d）组20226.53±28.18#13.23±1.63##大蒜素20 mg/（kg·d）组20241.60±31.24#10.62±1.19##

2.3肾脏组织病变的观察结果及病变评分的测定结果正常对照组大鼠肾小球、肾小管、间质区组织均未见异常，未见肾脏组织炎症病变和纤维化病变；CRF模型组呈现肾小球增大变性、球囊粘连、囊腔和管腔扩大，肾小管内结晶、坏死处可见大量炎症细胞和少量中性粒细胞浸润,间质纤维组织大量增生，呈慢性进行性肾脏纤维化改变；大蒜素5、10、20 mg/（kg·d）组能够不同程度改善CRF大鼠肾脏组织炎症病变和纤维化病变，以20 mg/（kg·d）组最为显著，结果见图1。CRF模型组大鼠肾脏组织病变评分显著升高（P＜0.01），大蒜素10、20 mg/（kg·d）组能够显著降低CRF大鼠病变评分（P＜0.01），结果见表4。

表4　各组大鼠肾脏组织病变评分（x±s）Tab.4　The scores of renal tissue lesions in rats of each group（±s）　分

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别　动物数　病变评分正常对照组　20　0.69±0.25模型组　20　9.43±0.58**大蒜素 5 mg/kg·d 组　20　8.14±0.76大蒜素 10 mg/kg·d 组　20　6.82±0.66##大蒜素 20 mg/kg·d 组　20　6.22±0.59##

2.4血清中C-IV、PC-Ⅲ、LN、FN水平测定结果与正常对照组比较，CRF模型组大鼠血清中C-IV、PC-III、LN含量水平显著升高且FN水平显著降低（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）组能够显著降低CRF大鼠血清C-IV、PC-Ⅲ、LN水平并提高FN 水平（P＜0.05或 P＜0.01）。结果见表 5。

表 5　各组大鼠血清中 C-IV、PC-III、LN、FN 水平（±s）Tab.5　The levels of C-IV,PC-III,LN and FN in serum of rats of each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数C-I V（n g/m L）P C-I I I（n g/m L）正常对照组　2 0　1 2.8 7±2.6 1　1 9.8 9±4.5 6模型组　2 0　6 7.5 3±8.3 9**　5 4.2 0±7.0 8**大蒜素5 m g/（k g·d）组2 0 5 9.1 8±9.1 7 4 7.5 4±7.9 4大蒜素1 0 m g/（k g·d）组2 0 4 0.2 6±7.1 2#3 2.0 3±5.8 9#大蒜素2 0 m g/（k g·d）组2 0 2 3.7 9±4.2 5##2 4.3 1±5.8 4##组别　动物数　L N（n g/m L）　F N（m g/L）正常对照组　2 0　2 5.0 8±1 1.0 2　1 4 7.6 1±3 3.8 5模型组　2 0　1 1 7.8 3±3 5.7 6**　6 6.7 2±1 3.0 9**大蒜素5 m g/（k g·d）组2 0 1 0 7.5 8±4 0.8 1 7 9.5 6±1 8.6 2大蒜素1 0 m g/（k g·d）组2 0 9 9.0 5±3 8.1 7 9 8.5 8±2 1.4 3#大蒜素2 0 m g/（k g·d）组2 0 8 3.4 2±2 8.8 3#1 2 5.9 6±2 5.1 2##

2.5血清中炎症因子含量测定结果CRF模型组大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量均显著升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）组能够显著降低CRF大鼠血清 CRP、TNF-α 含量（P＜0.05或 P＜0.01），其中20 mg/（kg·d）组能够降低IL-6含量（P＜0.05）。结果见表6。

表6　各组大鼠血清中炎症因子含量（±s）Tab.6　The levels of inflammatory factors in serum of rats of each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别　动物数 CRP（mg/L） IL-6（ng/L）　TNF-α（ng/L）正常对照组　20　5.30±1.07　40.83±2.19　71.90±3.52模型组　20　11.64±1.95**94.70±5.05**255.87±31.93**大蒜素5 mg/（kg·d）组2010.73±2.3090.06±6.28225.86±30.07大蒜素10 mg/（kg·d）组208.79±1.84#84.84±5.81184.37±24.15##大蒜素20 mg/（kg·d）组207.51±1.69##78.26±5.59#126.82±12.96##

2.6肾脏组织中Col I、PAI-1、MMP-1表达测定结果与正常对照组比较，CRF模型组大鼠肾脏组织Col I、PAI-1表达显著上调而MMP-1表达显著下调（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）组能够显著下调Col I、PAI-1 表达并上调 MMP-1（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果见表7和图2-4。

表7　各组大鼠肾脏组织中Col I、PAI-1、MMP-1表达OD 值（±s）Tab.7　The OD of the expression Col I,PAI-1 and MMP-1 in the kidney tissues in rats of each group（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别　动物数　Col I　PAI-1　MMP-1正常对照组　20　0.04±0.02　0.06±0.02　0.29±0.06模型组　20　0.27±0.05**0.31±0.08**0.04±0.02**大蒜素5 mg/（kg·d）组200.25±0.060.24±0.070.06±0.02大蒜素10 mg/（kg·d）组200.17±0.03#0.20±0.05#0.10±0.03#大蒜素20 mg/（kg·d）组200.09±0.03##0.16±0.04#0.22±0.05##

图1　各组大鼠肾脏组织病变（HE，×200）Fig.1　The renal tissue lesions in rats of each group(HE,×200)

图2　各组大鼠肾脏组织Col I表达（IHC，×400）Fig.2　The expression of Col I in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

图3　各组大鼠肾脏组织PAI-1表达（IHC，×400）Fig.3　The expression of PAI-1 in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

图4　各组大鼠肾脏组织MMP-1表达（IHC，×400）Fig.4　The expression of MMP-1 in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

3　讨论

本实验通过腺嘌呤溶液250mg/（kg·d）灌胃21d的方法建立CRF动物模型[10]，研究发现经大蒜素治疗28 d能够有效降低CRF大鼠血清 BUN、SCr、UA、24 h尿蛋白含量，抑制CRF大鼠肾脏组织病变，提高体质量并降低肾脏指数，提示大蒜素具有改善CRF大鼠肾功能、对其肾脏组织具有一定的保护作用。

肾脏组织纤维化是各种肾脏慢性疾病逐渐发展为CRF的共同病理通路，因此阻滞其纤维化是延缓CRF的必要途径。Col I是肾组织间质中存在的主要胶原成分，Col I大量积聚是肾组织纤维化的重要原因[11]。正常生理状态下，Col I生成与降解处于动态平衡，基质金属蛋白酶系（MMPs）和丝氨酸蛋白酶系（PAIs）是机体Col I表达的主要调控酶。MMPs系统中MMP-1和PAIs系统中的PAI-1对Col I及肾脏组织细胞外基质（ECM）的合成与降解起主要调控作用[12-13]。其中PAI-1具有抑制纤溶酶原激活物活化而抑制MMP-1活性的作用，因此在MMP-1、PAI-1构成的 Col I降解调控系统中，MMP-1是降解Col I的主要调控酶，而PAI-1主要是通过调节MMP-1活性而间接调控Col I的降解[11]。C-IV、LN、FN是构成ECM的主要成分，Border WA等[14]研究发现血清C-IV、LN含量升高及FN降低是慢性肾衰病变的重要临床指征。PC-Ⅲ是一种间质胶原，广泛存在于肾组织中，其聚集升高是促进肾脏组织纤维化和肾小球硬化的重要原因。本研究发现，经大蒜素治疗28 d能够有效降低CRF大鼠血清C-IV、LN、PC-Ⅲ含量并升高FN含量；通过IHC观察发现，经大蒜素治疗28 d能够有效下调CRF大鼠肾脏组织Col I蛋白表达并下调PAI-1表达、上调MMP-1表达，提示大蒜素调节MMPs、PAIs调控系统并调节血清C-IV、LN、PC-Ⅲ、FN含量而具有抑制CRF大鼠肾脏组织纤维化的作用。

肾脏组织纤维化病理机制非常复杂，杨婧等[15]研究发现炎症细胞浸润在肾脏组织纤维化病变过程中发挥着重要作用。血清炎症细胞因子（CRP、IL-6、TNF-α）含量水平是临床监测机体炎症反应的常用指标[16]。本研究发现，经大蒜素治疗28 d能够有效降低 CRF大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量水平，进而起到抑制炎症反应的作用。

综上所述，大蒜素可能通过抑制炎症反应和肾脏组织纤维化而对CRF大鼠起到一定的保护作用，机制可能与大蒜素调节MMPs、PAIs调控系统并调节血清C-IV、LN、PC-III、FN含量，以及抑制炎症反应有关。