远端肢体缺血预适应对冠心病患者血浆miRNA-21的影响和意义

陈云宪　唐良秋　陈兆基　梁家荣　张社兵　范文茂　陈宝峰　陈锦峰

512026 韶关，粤北人民医院心血管内科

远端肢体缺血预适应(remote ischemic preconditio-ning，RIPC)是目前预防缺血再灌注损伤的研究热点[1]，许多研究表明RIPC具有减轻冠状动脉支架置入术所引起的再灌注损伤，改善冠心病患者预后的作用[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)作为广泛参与调控细胞基因表达的内源性非编码小RNA，在冠心病的发展中起着重要的调节作用，其中miRNA-21在血管内皮细胞中高度表达。有研究表明，单向剪切力作用能促进内皮细胞表达miRNA-21，起到改善内皮细胞生理功能，减少内皮细胞凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤的作用[3]。RIPC必然是具有改变血管血流剪切力的作用，那么RIPC是否具有调控miRNA-21的表达水平，从而起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用，目前尚未见相关报道，有必要深入研究，进一步阐明缺血预适应可能的作用机制和临床应用价值。

1　对象和方法

1.1　研究对象

本研究为前瞻性队列研究。连续选取2015年6月至2017年2月在粤北人民医院心内科住院的冠心病心绞痛患者共165例作为研究对象，所有患者均符合中华医学会2010年心绞痛诊断指南标准。采用随机数字表法分为试验组85例和对照组80例：试验组男性56例，女性29例，年龄32～78岁，平均(59.0±12.3)岁；对照组男性48例，女性32例，年龄34～75岁，平均(58.1±11.7)岁。所有患者均行择期经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)，并置入雷帕霉素药物涂层支架(上海微创公司Firebird 2支架)，住院期间接受冠心病二级预防治疗。入选对象均为首次接受PCI术，排除各种急慢性感染性疾病、外伤、恶性肿瘤、结缔组织疾病、自身免疫性疾病、严重周围血管病变、急性脑卒中和严重肝肾功能不全等危重疾病。本研究方案获得医院伦理委员会批准(伦理号：2016YB11)，入选患者均签署知情同意书。

1.2　RIPC训练

试验组患者于入院后第2～4天共进行训练3 d，训练时间为上午8～9时和下午4～5时，过程由1名医生陪同观察。训练时将RIPC治疗仪(双臂自动治疗仪，深圳市华盈泰智能技术有限公司)的袖带绑于受试者双上臂，仪器自动充气加压至200 mmHg并维持5 min，袖带放气并维持5 min，重复5轮，共50 min。

1.3　血浆miRNA-21检测

所有患者均在入院后第2和5天早晨(即缺血预适应前后)空腹抽取静脉血标本，在室温下静置半小时，于1 000 g离心15 min，收集上清分装在无酶EP管中，80℃保存。使用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion，美国)提取血浆总miRNAs，提取过程按照说明书操作。使用TaqMan MicroRNA试剂盒(Ambion，美国)检测提取的总miRNAs中 miRNA-21表达。主要分以两个步骤：(1)反转录，引物结合至miRNA 3’端，然后进行反转录；(2)聚合酶链反应(PCR)，反转录产物通过实时定量PCR技术进行扩增。包括miRNA-21前向引物，反向引物以及碳氧荧光素颜料标记探针。使用U6作为内参基因，标准化miRNA含量。每组miRNA-21表达含量，通过delta-delta Ct公式计算得出。每个样品重复3次，取平均值。

1.4　记录临床指标和主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)

所有患者于入院时、手术当天早晨及术后12 h抽血检测高敏肌钙蛋白T(high sensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT)，完善心电图、超声心动图等常规检查。术中记录冠状动脉病变情况、置入支架数目、支架释放后TIMI血流分级(0级：无灌流；1级：微灌流；2级：部分灌流；3级：完全灌流)等。记录患者术后6个月内的MACE，包括心原性或全因死亡、急性心肌梗死、心绞痛反复发作、恶性心律失常(如室性心动过速、心室颤动、严重心动过缓)、支架内血栓形成、心原性休克、严重出血和心力衰竭[包括急性心力衰竭或心功能评定为纽约心脏病学会(New York Heart Association，NYHA)心功能分级Ⅲ～Ⅳ级]。

1.5　统计学方法

2　结果

2.1　两组患者一般临床资料和手术情况比较

两组患者的性别构成、年龄、冠状动脉病变情况和置入支架数目比较，差异均无统计学意义，但试验组患者支架释放后TIMI 3级血流比例明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2　两组患者血浆miRNA-21和hs-cTnT的变化比较

试验组与对照组入院后第2天早晨的血浆miRNA-21水平比较，差异无统计学意义(50.82±9.15比51.10±9.56，P>0.05)，而第5天的血浆miRNA-21水平比较，差异有统计学意义(86.25±12.24 比 60.52±10.29，t=3.216，P<0.01)；试验组第5天的血浆miRNA-21水平较第2天明显上升(t=4.113，P<0.01)，而对照组第5天的血浆miRNA-21水平较前无明显变化(P>0.05)。试验组PCI术后12 h的hs-cTnT变化值(术后12 h水平减去手术当天早晨的水平)明显低于对照组[(25.27±21.88)pg/ml 比(38.79±32.46)pg/ml，t=2.162，P<0.01)，见表2。

表1　两组患者一般临床资料和手术情况比较

表2　两组患者PCI术前后miRNA-21和hs-cTnT比较

2.3　两组患者MACE情况

术后6个月内，试验组有6例患者出现MACE，其中3例心功能衰竭，2例反复出现心绞痛，1例全因死亡；对照组有9例患者出现MACE，其中3例心功能衰竭，4例反复出现心绞痛，1例出现心室颤动，1例出现心肌梗死。

2.4　基线miRNA-21水平在出现和未出现MACE的患者间的差异

出现MACE的患者基线miRNA-21水平明显低于未出现MACE的患者(46.73±10.03比52.12±11.26，t=1.624，P=0.041)。

2.5　多因素logistic回归分析

将MACE设为因变量，将可能影响预后的各种因素设为自变量，先行单因素分析，结果显示基线miRNA-21、术后TIMI血流分级、年龄、糖尿病病史、左心室射血分数、术后12 h的hs-cTnT水平、BNP、心功能NYHA分级、冠状动脉病变数目是MACE的危险因素(均为P<0.05)。利用多因素logistic回归分析危险因素对预后的影响，发现基线miRNA-21、左心室射血分数、心功能NYHA分级、冠状动脉病变数目是冠心病患者PCI术后6个月内发生MACE的独立危险因素(均为P<0.05)，见表3。

表3　多因素logistic回归分析结果

3　讨论

RIPC是目前缺血性心脏病的研究热点，大量研究表明，RIPC具有减轻心肌缺血再灌注损伤、改善血管内皮功能的作用[1，4]。冠状动脉支架置入术的操作过程会对心肌细胞造成一定损伤，有学者通过对PCI术后患者进行增强心脏磁共振成像检查发现，术后肌钙蛋白I(cTnI)升高的患者出现新发不可逆的心肌损失，且损伤程度直接与cTnI的升高程度成正比[5]。Hoole等[6]把接受择期PCI的患者随机分成RIPC组和非RIPC组，并通过检测术后24 h的cTnI水平评估缺血预适应在PCI中的心脏保护作用，发现RIPC组患者术后的中位cTnI水平明显低于非RIPC组(P=0.04)，同时发现RIPC组患者术后出现胸痛及心电图ST段改变少于非RIPC组。有荟萃分析也证实了RIPC能减轻PCI术后心肌再灌注损伤，改善冠心病患者的预后[7-8]。本研究结果也提示，接受RIPC的冠心病心绞痛患者择期PCI术后12 h的hs-cTnT变化值明显低于对照组(P<0.05)，与上述研究结果一致，再次验证了RIPC的心脏保护作用。本研究追踪了所有行择期PCI术的心绞痛患者6个月内的MACE情况，并未发现两组有显著差异，但试验组的MACE发生率有减少趋势，可能需要更大的样本量证实RIPC对冠心病患者预后的影响。

miRNAs是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，广泛参与心脏发育和心血管疾病的发生发展[9]。miRNA-21是一种高度表达于血管内皮细胞、心肌细胞的基因调节因子，在缺血性心脏病中发挥着重要的生理作用。Dong等[10]发现，miRNA-21在急性心肌梗死小鼠模型中的心脏梗死区表达明显下降，在梗死边界区高表达，而缺血预适应能提高心肌梗死区miRNA-21的表达水平。通过腺病毒转染过表达miRNA-21能明显减少大鼠心肌梗死面积，并且减少左心室容积，证实miRNA-21对缺血诱发的细胞凋亡起到保护作用。研究者认为，miRNA-21可能通过调节细胞程序性死亡基因4和多个心肌保护介质，包括激活蛋白1、内皮型一氧化氮合酶、热休克蛋白70和热休克转录因子1等起到心肌和血管内皮的保护作用[3]。也有研究表明，外周血miRNA-21水平与冠心病患者冠状动脉病变严重程度呈正相关[11]。Weber等[12]通过单向剪切力作用利用脐静脉内皮细胞进行研究，发现miRNA-21在有剪切力组比对照组表达增加了5.2倍，过表达miRNA-21后发现血管内皮细胞凋亡比正常对照组明显减少。有研究表明[13]miRNA-21在急性STEMI患者血浆中、泡沫细胞及AS斑块内的水平明显升高，过表达miR-21及沉默其靶基因程序性细胞死亡因子4(PDCD4)可抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化，从而发挥抗AS的作用。本研究发现，RIPC组患者的血浆miRNA-21表达水平明显升高，可能是因为RIPC改变血管内皮的剪切力，引起血管内皮表达miRNA-21增加。本研究还发现，出现MACE的患者血浆miRNA-21表达水平明显下降，多因素logistic回归分析发现基线miRNA-21是冠心病患者PCI术后6个月内MACE的独立危险因素之一，提示血浆miRNA-21水平可能是评估冠心病患者预后的重要标志物。

综上所述，RIPC对冠心病患者的血管内皮功能和心肌缺血再灌注损伤具有良好的保护作用，其作用机制之一可能是通过调控miRNA-21的表达水平实现的。miNRA-21通过调控靶基因起到重要的心脏保护作用，可能是缺血性心脏病的重要标志物及治疗靶点，在多种心脏疾病上有着良好的临床应用前景。目前RIPC的最佳疗程并不清楚，此外RIPC对miRNA-21的调节机制仍然需要更多的基础研究加以证实。

利益冲突：无