大黄酒炙前后配伍山楂水煎液中7种成分含量测定

2018-07-12赵娟沈建平杨月东王新东

中国中医药信息杂志 2018年4期

赵娟　沈建平　杨月东　王新东

摘要：目的建立大黄酒炙前后配伍山楂水煎液中7种成分含量测定的方法，为大黄酒炙前后配伍山楂的临床应用提供参考。方法采用HPLC，Thermo-C18 endcapped 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为0.1%磷酸水-乙腈，梯度洗脱，柱温25 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。结果水煎液中没食子酸、绿原酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚7种成分均能达到基线分离、线性关系良好，平均回收率分别为104.2%、100.3%、99.8%、102.8%、103.5%、98.5%、99.5%，RSD均小于2.7%。该方法的精密度、稳定性、重复性良好。酒大黄较生大黄除没食子酸含量升高外，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均不同程度下降。山楂与生大黄、酒大黄配伍后，水煎液中绿原酸含量有所上升。结论该方法可以用于大黄酒炙前后配伍山楂水煎液中7种成分的含量测定，为其临床应用提供参考。

关键词：大黄；酒炙；山楂；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.018

中圖分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0087-04

Abstract： Objective To establish a content determination method for 7 components of water decoction of compatibility of Crataegi Fructus and Rhei Radix et Rhizoma before and after stir-frying with wine； To provide a reference for the clinical compatibility of Rhei Radix et Rhizoma and Crataegi Fructus. Methods HPLC was performed on the column of Thermo-C18 endcapped column （250 mm×4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase was 0.1% phosphoric acid water-acetonitrile system and a linear gradient elution was used. The column temperature was 25 ℃， and the injection volume was 10 μL. The detection wavelength was set at 254 nm. Results The seven markers including gallic acid， chlorogenic acid， aloe-emodin， rheinic acid， rheum emodin， chrysophanic acid and emodin monomethyl ether， reached baseline separation. The linearity was good， and the average recovery was 104.2%， 100.3%， 99.8%， 102.8%， 103.5%， 98.5%， and 99.5%. RSDs of 7 components were all less than 2.7%. The method showed high precision， stability and reproducibility. After prepared with wine， gallic acid content increased in Rhei Radix et Rhizoma， while aloe emodin， rhein， emodin， chrysophanol and physcion decreased to varying degrees. The content of chlorogenic acid increased in water decoction of compatibility of Crataegi Fructus Rhei Radix et Rhizoma. Conclusion The method can be used for the content determination of 7 components of water decoction of the compatibility of Rhei Radix et Rhizoma and Crataegi Fructus before and after stir-frying with wine， providing references for clinical application.

Keywords： Rhei Radix et Rhizoma； stir-frying with wine； Crataegi Fructus； HPLC

化浊活血方是南京中医药大学附属江苏省中西医结合医院用于治疗冠心病经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后再发胸痛的有效验方，由江苏省首批著名中西医结合专家高丙麟老先生结合多年临床经验总结而来。中医学认为，冠心病PCI术后发生胸痛的根本原因是本虚，即心阳气虚；直接原因是标实，即实浊内生，痹阻心脉。形成实浊的病理因素是寒、痰、瘀、毒、湿[1]。本方由酒大黄、山楂、黄芪、丹参组成，药少而精，专攻化浊补气活血，具有抗血小板、降脂、稳定斑块、止痛作用[2-4]，与现代医学防治冠心病PCI术后再狭窄引起胸痛的原则不谋而合。根据中医“急则治标，缓则治本”原则，方以酒大黄为君药，配伍山楂，活血化浊，以治其标，在方中发挥主要功效；黄芪与丹参配伍，补气以行津血，绝痰瘀之源，治其本。现代药理研究表明，酒大黄配伍山楂具有降低血清胆固醇及三酰甘油、改善血液流变学、抗血小板聚集、抗氧化和抗炎作用[5-6]，与现代医学通过改善冠脉血供同时治疗冠脉粥样硬化来防治冠心病PCI术后再狭窄引起胸痛的治疗原则相符[7]。因此，酒大黄与山楂配伍在本方中发挥主要功效。本方用于临床数十年，疗效显著。曹宁[8]通过实验研究发现，复方中大黄功效的发挥方向受配伍环境、剂量、剂型、炮制、煎服方法等因素影响，其中以配伍环境为最主要的影响因素。本研究采用HPLC对大黄酒炙前后与山楂水煎液中没食子酸、绿原酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚7种成分进行含量测定，为化浊活血方的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱系统（美国WATERS公司），BT25S型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司），As3120型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

没食子酸、绿原酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚对照品（批号161223、161438、13030701、130312103、13022715、14031711、13022005，纯度均≥98%），成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为双蒸水，磷酸为优级纯。

生大黄、山楂购自贵州同德药业有限公司，批号分别为20170101-02、20170305-02。酒大黄按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）0213炮制通则酒炙法[9]炮制：取净大黄片，用黄酒拌匀，闷润至酒被吸尽，置预热适度的炒制容器内，用文火炒至颜色加深，炒干，略有酒香气后取出晾凉，筛去碎屑。每100 kg大黄片用黄酒10 kg。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo-C18 endcapped（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，95%A；8～25 min，95%～60%A；25～45 min，60%～25%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、绿原酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚对照品适量于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。精密量取适量对照品溶液至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液，各对照品浓度分别为：没食子酸150 ?g/mL，绿原酸98 ?g/mL，芦荟大黄素12.8 ?g/mL，大黄酸12 ?g/mL，大黄素15.6 ?g/mL，大黄酚10.0 ?g/mL，大黄素甲醚3.24 ?g/mL。

2.3 供试品溶液的制备

取生、酒大黄饮片各5 g，山楂5 g，用10倍量水（100 mL）浸泡30 min后，回流提取15 min，纱布过滤，药渣再加8倍量水（80 mL）回流提取15 min，纱布过滤，合并滤液，即得生、酒大黄配伍山楂水煎液。13 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察

将混合对照品溶液分别稀释0、2、4、8、16倍，将稀释液注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度（?g/mL）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，重复进样6次，计算7种成分峰面积RSD分别为1.6%、0.1%、1.0%、1.9%、2.0%、1.7%、1.5%。均符合含量测定要求。

2.6 稳定性试验

按“2.1.3 ”項下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 精密吸取10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算7种成分峰面积RSD分别为2.1%、0.3%、1.2%、0.5%、2.5%、1.1%、1.9%。均符合含量测定要求。

2.7 重复性试验

按“2.1.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定7种成分含量，计算RSD分别为1.5%、1.8%、0.9%、2.0%、1.2%、2.5%、0.7%。均符合含量测定要求。

2.8 加样回收率试验

精密称取生大黄饮片2.5 g、山楂2.5 g，分别精密加入没食子酸、绿原酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚6.6、0.8、0.7、0.8、0.2、0.2、0.05 mg。按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算7种成分的平均回收率和RSD，结果没食子酸、绿原酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率分别为104.2%、100.0%、99.8%、102.8%、103.5%、98.5%、99.5%，RSD分别为1.1%、1.7%、1.6%、1.5%、0.9%、2.7%、1.9%。

2.9 样品含量测定

称取山楂及生、酒大黄样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，平行3份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算7种成分的含量，结果见表3。

3 讨论

大黄、山楂经常在临床中配伍使用，以活血化浊为主要功用。本研究建立了大黄酒炙前后配伍山楂水煎液中7种成分HPLC含量测定方法，其中包括药典中大黄测定项下规定的5种成分及没食子酸，同时测定了山楂中绿原酸的含量，为大黄配伍山楂的质量控制以及临床应用提供了参考。

大黄味苦，性寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经。功能泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经。生大黄苦寒，泻下作用峻烈，经酒炙后可以缓和其苦寒之性，增强活血化瘀功效，兼可引药上行。山楂味酸、甘，性微温，入脾、胃、肝经，功能消食化积、活血散瘀。山楂善于消食积与散瘀血、祛脂化浊。山楂通过调控多种脂肪代谢酶的机制调节血脂[10]。从本研究结果可以看出，与生大黄比较，酒大黄山楂水煎液中除没食子酸含量升高外，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚均不同程度下降。山楂与酒大黄配伍的水煎液中，绿原酸含量有所上升。其中，溶出增多的没食子酸在心血管疾病的防治中有着重要作用，可抗高血压、抗心肌梗死、抗血管钙化[11]。山楂中的绿原酸具有保护心血管、降糖、降脂、抗菌、抗病毒、抗白血病、抗诱变、抗癌等药理作用[12]。

本研究建立的HPLC方法可以同时测定生、酒大黄配伍山楂水煎液中7种成分含量，为化浊活血方的质量控制及临床应用提供参考。本研究显示，酒大黄较生大黄配伍山楂的水煎液更有利于有效成分溶出，并减少峻下成分析出。化浊活血方中运用酒大黄可增强活血化瘀功效，有效预防冠心病PCI术后再发胸痛。

参考文献：

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