针刺对失眠大鼠血清去甲肾上腺素、多巴胺及5—羟色胺含量的影响

郭鑫　岳增辉　谢菊英　吴雪芬　郑雪娜

摘要：目的 观察循经选穴针刺对失眠大鼠外周血清单胺类神经递质5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）含量及腧穴配伍效应的影响，探讨针刺治疗失眠症的作用机制。方法 将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组和百会+非经非穴组，每组12只，腹腔注射对氯苯丙氨酸混悬液制作大鼠失眠模型，各针刺组针刺相应腧穴，每次30 min，连续7 d。ELISA检测大鼠血清NE、DA、5-HT的含量。结果 与空白组比较，模型组大鼠血清5-HT、DA、NE含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，各针刺组大鼠血清DA、NE含量明显降低（P<0.05，P<0.01），百会+三阴交组大鼠血清5-HT含量明显降低（P<0.05）；各针刺组间比较，百会+神门组总体疗效优于百会+三阴交组及百会+非经非穴组。结论 针刺改善大鼠睡眠结构可能与血清单胺类神经递质含量有关，循经选穴针刺可能是影响腧穴配伍效应的因素之一。

关键词：针刺；失眠；循经选穴；去甲肾上腺素；多巴胺；5-羟色胺；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.010

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0046-05

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture in acupoints at different meridians on 5-HT， DA， NE in the peripheral serum of insomnia rats； To explore the mechanism of action of acupuncture for the treatment of insomnia. Methods Sixty SD rats were randomly divided into blank group， model group， Baihui+Shenmen group， Baihui+Sanyinjiao group， and Baihui+non-acupoint group， with 12 rats in each group. Injection of PCPA suspension of rats was used to establish insomnia model. Each acupuncture group received corresponding acupoints， 30 min each time， for 7 days. The levels of 5-HT， DA and NE in serum were measured by ELISA. Results Compared with the blank group， the levels of 5-HT， DA and NE in the model group were significantly higher than those in the blank group （P<0.01）. Compared with the model group， the contents of DA and NE in the acupuncture groups were significantly lower than those in the model group （P<0.05， P<0.01）， and the 5-HT in Baihui+Sanyinjiao group was significantly lower than those in the model group （P<0.05）. Among all acupuncture groups， overall efficacy of Baihui+Shenmen group was better than Baihui+Sanyinjiao group and Baihui+non-acupoint group. Conclusion Acupuncture can improve sleep structure in rats may be related to serum monoamine neurotransmitters. Acupuncture in acupoints at different meridians may be one of the influencing factors of acupoint compatibility effects.

Keywords： acupuncture； insomnia； acupoints at different meridians； norepinephrine； dopamine； 5-hydroxy tryptamine； rats

失眠是指入睡困難、睡眠维持障碍和早醒，且对睡眠时间或质量不满意，继而影响日常功能的一种主观体验[1]。现代生物学研究认为，自主昼夜节律和睡眠内稳态驱动共同参与调节睡眠-觉醒周期[2]，褪黑素（melatonin，MT）作为一种内源性生理物质，是该节律调节系统的重要组成部分，其与受体结合后，促使或抑制与睡眠-觉醒周期相关单胺类神经递质的释放，从而发挥调节睡眠的作用[3]。近年来研究表明，失眠与血中单胺类神经递质的含量有关，参与觉醒的神经递质多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）属兴奋性神经递质，一般规律为二者含量越高动物越清醒，而高水平的5-羟色胺（5-HT）释放是维持觉醒状态的必要条件[4-7]。针刺作为一种有效治疗和改善失眠的手段，在临床研究中不断得到验证[8]，而正确的腧穴配伍是提高针刺疗效的关键因素之一[9]。循经选穴为临床治疗中最常用的取穴方法之一，是指在疾患所属经脉的循行路线上选取穴位来治疗此病。本课题以对氯苯丙氨酸（PCPA）所致的失眠大鼠模型为实验对象，以针刺“百会”“神门”“三阴交”等为治疗手段，ELISA检测血清5-HT、DA、NE的含量，研究不同经络选穴针刺治疗失眠是否与外周血中单胺类神经递质的含量变化相关，从而探讨针刺治疗失眠症的疗效机制及循经选穴针刺对腧穴配伍效应的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠60只，8～9周龄，体质量220～250 g，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。正式实验开始前，大鼠适应性分笼饲养1周，每笼5只。饲养于湖南中医药大学实验动物中心实验室，温度23～26 ℃，相对湿度45%～65%。

1.2 主要试剂与仪器

PCPA，美国Sigma公司，批号SHBC0245V；戊巴比妥钠，Merck公司，批号908M034；碳酸氢钠，成都市科龙化工试剂厂；氢氧化钠，成都市科龙化工试剂厂；阿拉伯胶，天津市光复精细化工研究所。动物型超纯水机，摩尔公司；pH精密试纸，垫中垫公司；电热水恒温杯，Promega公司；台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；自动平衡离心机，湘仪离心机仪器有限公司；全自动酶标洗板机，汇松科技发展有限公司；多功能酶标分析仪，汇松科技发展有限公司；恒温培养箱，Promega公司；华佗牌一次性0.25 mm×25 mm无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司。

1.3 分组

饲养1周后将实验大鼠随机分为空白组、模型组、百会+神门组、百会+三阴交组和百会+非经非穴组，每组12只。

1.4 造模

采用经典PCPA造模方法建立失眠大鼠模型[10]。實验开始前，大鼠先适应性自由进食喂养7 d，保持鼠笼干燥清洁，7 d后称重。除空白组外，其余各组第8日开始腹腔注射PCPA混悬液（50 mg/mL），每日1次，连续2 d，制作失眠大鼠模型。PCPA临用前按大鼠500 mg/kg体质量用量，用事先配制好的弱碱性生理盐水配制成混悬液。预实验测得PCPA按大鼠35 mg/kg体质量为引起100%大鼠失眠的最小阈剂量。取与大鼠体质量相对应剂量的混悬液腹腔注射。同时，空白组予等体积弱碱性生理盐水腹腔注射。首次注射PCPA混悬液36 h后，观察模型组大鼠生理状态，失眠大鼠会出现昼夜节律缺失、日间与夜晚皆活动不断、对外界刺激异常敏感、烦躁不安等症状，结合采用经典的戊巴比妥钠翻正实验，观察空白组与模型组大鼠的睡眠潜伏期及睡眠总时间的差异，进行失眠模型评价，模型组与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）为造模成功。本实验模型组大鼠注射戊巴比妥钠后睡眠潜伏期较造模前明显延长，睡眠总时间明显缩短（P<0.05），提示造模成功[11]。

1.5 干预

造模后，于第2次注射PCPA混悬液24 h后，开始对实验大鼠进行操作。各针刺组大鼠选穴参考大鼠穴位定位[12]。空白组大鼠常规饲养，不做任何处理；模型组大鼠予仰卧位束缚于鼠板上，只捆绑，不进行针刺，每日1次，每次30 min，连续7 d，每日捆绑结束后正常进食；百会+神门组选取“百会”（位于顶骨正中处）、双侧“神门”（位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘）；百会+三阴交组选取“百会”、双侧“三阴交”（位于后肢内踝尖直上10 mm）；百会+非经非穴组选取“百会”“非经非穴点”（位于肘内侧，肘尖与腋窝连线中点）[13]，非经非穴点在非经脉循行路线上及非穴位所在部位，此点参照成都中医药大学所制定的选穴方法。具体操作如下：将大鼠仰卧位束缚于鼠板上，定穴后剪毛、消毒，采用0.25 mm×25 mm针灸针进行针刺，百会从后向前平刺20 mm，神门直刺1 mm，三阴交和非经非穴点均直刺5 mm，留针30 min，每10 min行针1次，行针时间1 min，不提插、只捻转，行平补平泻手法，幅度和频率为均等手法，30 min时，在行针结束后出针，每日1次，每日治疗后正常进食，连续7 d。

1.6 观察指标

1.6.1 行为学观察

观察大鼠精神状态、动作与反应灵敏性、昼夜节律，体质量及活动度、饮食饮水等与失眠症相关指标。

1.6.2 生化指标检测

治疗结束后，各组大鼠禁食12 h，腹主动脉采血3 mL，室温自然凝固10～20 min，2000～3000 r/min离心20 min，收集上清液，置于-20 ℃冰箱保存备用。ELISA检测血清NE、DA、5-HT含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学观察比较

空白组大鼠昼夜节律及行为活动正常，大小便情况变化不明显，毛发光泽；模型组和各针刺组大鼠在注射PCPA混悬液后出现白天夜晚活动不停，昼夜节律消失、互相打斗，毛发光泽度差，笼内垫料较空白组潮湿，粪便颜色变浅。

2.2 大鼠死亡情况

实验中共有7只大鼠死亡，其中模型组4只、百会+三阴交组1只、百会+非经非穴组2只。

2.3 针刺对模型大鼠血清去甲肾上腺素含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清NE含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组大鼠血清NE含量明显降低（P<0.01）；与百会+神门组比较，百会+三阴交组和百会+非经非穴组大鼠NE含量变化明显（P<0.05，P<0.01）；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠血清NE含量变化明显（P<0.01）。结果见图1。

2.4 针刺对模型大鼠血清多巴胺含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清DA含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，百会+神门组、百会+三阴交组、百会+非经非穴组大鼠血清DA含量明显降低（P<0.01）；与百会+神门组比较，百会+非经非穴组大鼠血清DA含量变化明显（P<0.01）；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠血清DA含量变化明显（P<0.01）。结果见图2。

2.5 针刺对模型大鼠血清5-羟色胺含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清5-HT含量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，百会+三阴交组大鼠血清5-HT含量明显降低（P<0.05），百会+神门组和百会+非经非穴组5-HT含量无明显变化（P>0.05），但有下降趋势；与百会+神门组比较，百会+三阴交组和百会+非经非穴组大鼠血清5-HT含量無明显变化（P>0.05）；与百会+三阴交组比较，百会+非经非穴组大鼠血清5-HT含量变化明显（P<0.01）。结果见图3。

3 讨论

古人对失眠有“不寐”“目不瞑”“不得眠”等描述，其病因病机主要为阴阳气血失调、肝失疏泻、心肾不交、心神失养、脾胃不和、虚火扰心、痰瘀互结等[14]。百会，系督脉之要穴，一身阳气汇聚之处，具有安神健脑之功效，《针灸大成》有“思虑劳伤心脾，灸百会”的记载，足见百会治疗失眠的作用。神门，系手少阴心经之原穴，具有镇心安神之功效。心主血脉，又主神明，为君主之官，是五脏六腑之大主，精神之所舍。可见失眠与心的关系非常紧密，而作为心经的原穴，神门对治疗失眠起着非常重要的作用。三阴交系足太阴脾经之要穴，也是肝、脾、肾三条阴经交会之处，从失眠病因病机可知，其与此三脏关系非常紧密，所以，三阴交也是治疗失眠的重要腧穴。研究发现，古代治疗失眠的156个针灸处方中，神门和三阴交最为常用且疗效显著[15]。临床中腧穴配伍十分常见，其主要目的是发挥穴位的协同作用，以提高临床疗效，因为并非任意穴位相配都可起到良性作用[16]。有研究表明，针刺不同经穴对家兔胃黏膜的保护作用中足阳明胃经效果较其他经脉更高[17]，表明疾病所属脏腑本经穴位的治疗效果优于他经穴位。

作为目前临床运用广泛的腧穴配伍方法之一，按经脉配伍及循经选穴包括选择本经脉上的腧穴配伍治疗该脏腑病或经脉病的本经配伍[18]。本课题以失眠为研究对象，心主神志，将百会作为固定穴，循经选穴取“神门”，辨证取穴选“三阴交”，再以“非经非穴组”作为对照，使实验设计更为合理。

睡眠是中枢神经内部发生主动调节的过程，其发生与某些特定结构及不同递质的作用密切相关[19]，单胺类神经递质就是其中之一，包括DA、NE、5-HT等。DA、NE被认为是与觉醒有关的中枢神经递质，行为觉醒的维持可能与DA递质系统有关，而脑电觉醒的维持则与NE递质系统有关[4]，DA为合成NE的前体物，关于脑内DA神经元对睡眠和觉醒的影响，一般认为脑内DA神经元兴奋，动物觉醒增加，睡眠少；反之，觉醒少，睡眠增加。5-HT在人体除骨骼肌、外周神经和肾上腺外，其余各组织器官中广泛分布，作为上行激活系统的重要组成部分在维持觉醒和警觉状态中发挥重要作用，但其与睡眠-觉醒关系还在继续探索之中。有学者认为，5-HT既是促进觉醒又是促进慢波睡眠的物质，而究竟发挥哪方面的作用可能与哪种5-HT受体亚型系统被激活有关，与被激活发生的时间也相关[20]。但本研究中尚未发现其明显作用，需进一步研究探讨。

本实验采用PCPA经典失眠造模方法，以戊巴比妥钠翻正实验指标来确定造模成功与否。与空白组比较，模型组睡眠时间明显缩短、睡眠潜伏期明显延长（P<0.05），提示失眠造模成功，且各单胺类神经递质均较空白组明显升高（P<0.01）。与模型组比较，各针刺组DA和NE含量明显降低（P<0.01），显示出一定改善睡眠的疗效，起到安神镇静的作用；而各针刺组5-HT含量变化不明确，究其原因：首先，本研究为动物实验，其中存在一些不可控因素，进一步的研究可考虑加大样本量以完善整个研究，这样有助于更好地阐明大鼠血清5-HT含量在失眠治疗中的作用。国外许多研究者早将5-HT转换率（五羟吲哚乙酸/5-羟色胺）作为5-HT能神经元兴奋性指标来进行促眠分析[21-23]，本研究仍采用测量5-HT含量的方法，有待改进；其次，本课题取材于股动脉，由于血脑屏障的存在，5-HT很难通过血脑屏障作用，而以往研究大多取材为大脑，取材部位的不同可能导致不同的结果；再次，5-HT含量变化与睡眠有关，但是否可将其作为观察治疗失眠疗效的特异性指标，这点还值得继续探索。各针刺组间比较，百会+神门组和百会+三阴交组对降低失眠大鼠血清DA含量水平相当，且两者作用均明显优于百会+非经非穴组（P<0.01），而百会+神门组在降低血清NE水平上，明显优于其余2组（P<0.05，P<0.01），表明神门治疗失眠症效果最优，三阴交疗效次之，这也正好说明固定穴位配伍本经穴位效果优于其他穴位，循经选穴是影响腧穴配伍效应的因素之一。

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（收稿日期：2017-10-11）

（修回日期：2017-10-24；编辑：华强）