miRNA-155在食管癌中的表达及与其临床病理特征的关系

聂　龙　周方正　童　琳　潘东风　张东升　王小聪　谢　辉　郭思言

微小RNA(miRNA)是1种能够参与蛋白的合成以及调控机体细胞活动的小分子非编码RNA，其长度大约在21～25个核苷酸[1]。据研究报道，miR-155在肺癌[2]，乳腺癌[3]和胰腺癌[4]等多种肿瘤中均存在高表达。但是还未见miR-155在食管癌中表达的相关研究报道。因此本研究通过采用RT-PCR方法检测miR-155在食管癌组织以及癌旁组织中的表达差异，并分析两者的表达与食管癌患者临床病理特征的相关性，进而探讨其对食管癌发生，转移的影响。

1　材料与方法

1.1　一般资料

选取2014年5月至2016年6月本院食管癌手术切除标本及对应的癌旁组织各80例，其中男性52例，女性28例，平均年龄42～76岁，所有患者术前均未接受化疗，放疗等其他疗法，所有组织标本分别于癌旁组织4 cm以内、无坏死癌灶及正常黏膜组织处取材。组织经4%多聚甲醛固定，常规脱水，包埋后连续切片，切片厚度控制在4 μm，进行苏木精-伊红染色(HE)染色，经专业病理科老师诊断确诊为食管癌。按WHO分类标准(1996)进行组织学分级：高分化34例，中分化25例，低分化21例。淋巴结转移者38例，无淋巴结转移者42例。标本采集经本院医院伦理委员会的审批和认可。

1.2　方法

1.2.1主要试剂Trizol Reagent购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒和cDNA扩增试剂盒均购自MBI Fermentas公司。BioRAD-IQ5 qRT-PCR仪购自美国BioRad公司。

1.2.2RT-PCR检测组织中miR-155的表达取对数生长期细胞，采用Trizol试剂一步法提取细胞中的RNA，将细胞RNA反转录成cDNA,然后扩增成DNA(所有步骤严格按照逆转录试剂盒和扩增试剂盒说明书操作)。miR-155引物序列：上游：5-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3，下游：5-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3；以GAPDH作为内参，引物序列：上游：5-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3；下游：5-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3。所有引物序列均由上海生物工程技术有限公司合成。RT-PCR反应条件如下：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃变形30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，40个循环，最后70 ℃延伸10 min结束。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统(Bio-Rad,USA)测条带灰度值。

1.2.3miR-155表达水平的计算方法以目的基因miR-155与内参基因GAPDH灰度值的比值反映miR-155的相对表达量。至少选取3例数据求取平均值。取食管癌患者癌旁正常组织miR-155的表达水平为1，以此为对照，计算食管癌患者癌组织中miR-155的表达水平(以倍数表示)[5]。

1.3　统计学方法

应用SPSS 22.0统计分析软件对数据进行统计分析。miR-155表达与食管癌患者临床病理特征之间的关系采用Mann-Whitney检验，计量资料用均数±标准差表示，组间的比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　miR-155在食管癌组织与癌旁组织中的表达

RT-PCR结果显示，食管癌组织中miR-155的表达水平为0.437±0.091，与癌旁组织相比差异具有统计学意义(t=25.184，P=0.007)，见图1。

2.2　miR-155表达与食管癌临床病理特征的关系

食管癌组织中miR-155表达与患者性别和年龄无关(P>0.05)；与食管癌组织学分级，肿瘤浸润深度，淋巴结转移和TNM分期均有一定的关系(P<0.05),见表1。

1为食管癌组织；2为癌旁组织

表1　miR-155表达与食管癌临床病理特征的关系

3　讨论

Has-miR-155是非编码基因BIC(B-cell integration cluster，BIC)转录所形成。近年的研究更多的聚焦于机体炎症反应调控以及血液性肿瘤的研究，但是关于miR-155与实体肿瘤的相关性研究少见报道。本研究结果显示，食管癌患者组织中miR-155的表达水平显著低于对应的癌旁组织，并且差异具有统计学意义。同时对80例食管癌组织中miR-155的表达水平与患者临床病理之间的相关性进行分析，结果发现食管癌组织中miR-155的表达与患者的性别和年龄无关(P>0.05)；与患者食管癌的组织学分级，肿瘤的浸润深度，淋巴结转移和TNM分期均有一定的关系(P<0.05)。

有研究发现miR-155在肺癌[6]，胃癌[7]和乳腺癌[8]等实体肿瘤中呈现高表达，并且与肿瘤的发生，发展密切相关。同时报道miR-155的高表达与其抑癌作用存在一定的关系。Dorsett等[9]研究发现，高表达的miR-155通过抑制AID(activation-induced cytidine deaminase)产生的潜在癌基因转位来发挥抗癌的作用。同期研究中也有报道miR-155高表达与促癌作用存在一定的联系。Ovcharenko等[10]研究发现，高表达的miR-155可以通过抑制凋亡基因caspase-3的表达来抑制肿瘤的凋亡，从而促进肿瘤细胞的生长。Valeri等[11]研究发现在结肠癌患者组织中miR-155的表达水平与错配修复蛋白MLH1或MSH2表达呈现负相关，结果提示miR-155可以通过调控错配修复蛋白MLH1或MSH2表达来促进结肠癌肿瘤的发生与发展。Pedersen等[12]在造血细胞增殖机制的研究发现，SHIP1是调节造血细胞增殖与分化的因子，而miR-155可以作用了靶基因SHIP1进而发挥促进细胞生长的作用。Jiang等[13]在乳腺癌细胞中研究发现miR-155可以通过抑制细胞因子信号转导蛋白1来促进乳腺癌细胞的增殖与生长。

近年的研究也证实，miR-155在炎症反应和免疫中发挥中重要的作用。miR-155可以通过上调炎性T细胞的活性来促进炎症反应的发生[14]。Vigorito等[15]研究也发现miR-155在淋巴细胞免疫反应中发挥着关键性的作用。另外，miR-155基因敲除的老鼠细胞因子的分泌降低并且T细胞依赖的抗体反应减弱[16]。而炎症细胞和炎症反应在肿瘤的发生发展中具有重要作用。因此我们推测食管癌患者组织中miR-155表达的降低可能是导致机体炎症反应以及抗癌机制的失衡，从而促进肿瘤细胞的生长。

综上，食管癌患者组织中miR-155的相对表达降低，可能抑制了机体抗癌作用，从而促进食管癌的发生与发展，但是具体的作用机制还需要进一步的研究。