菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1的克隆及表达分析

刘洪磊,张雅芬,余佳佳,叶子弘

(中国计量大学 生命科学学院,浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

茭白(ZizanialatffoliaTurez.)又称“菰”,是长江中下游地区重要经济作物,也是我国第二大水生蔬菜.余永年认为是菰黑粉菌侵入茭白植株,诱使植株产生大量吲哚乙酸,从而刺激茭白基部膨大形成了肉质鲜美的可食用茭白[1].在正常茭白中,菰黑粉菌多以菌丝形态存在,称为MT型,而在灰茭中,菰黑粉菌在侵染早期即形成大量肉眼可见的褐色冬孢子堆,称为T型[2].对茭白不同生长阶段的组织中菰黑粉菌的分布进行显微观察,发现在茭白膨大初期,菌丝急剧生长[3-4].所以,菰黑粉菌菌量的迅速累积和双核菌丝的生长可能是茭白植株孕茭的重要原因.

研究表明,黑粉菌的菌丝生长及增殖与其二型态转变密切相关,主要受环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信号途径来调控其极性生长,并通过丝裂原活化蛋白激酶MAPK(mitogen activated protein kinase)信号途径控制细胞延伸过程,共同作用于细胞融合及菌丝生长,从而实现侵染和扩散[5].在菰黑粉菌近缘真菌玉米瘤黑粉菌中,a信息素信号和受体通过cAMP和MAPK信号途径影响性亲和单倍体菌株融合形成双核菌丝,从而影响致病性[6-7].研究表明,玉米瘤黑粉菌缺失Rak1后,其接合管形成能力减弱,细胞融合形成双核菌丝概率大大降低[8];当MAPK信号途径被激活或加入一定浓度的外源cAMP,Rak1缺失的性亲和菌株的接合管形成能力恢复[8].因此Rak1可能参与激活cAMP/PKA和MAPK信号途径,从而参与调控细胞生长、融合[8].进一步研究发现,Rak1可能是prf1激活子rop1的调节因子,从而实现信息素和信息素受体基因表达的调控[8].

WD-重复蛋白是一个含有多个高度保守的GH(glycine-histidine)和WD(tryptophan-aspartic acid)序列的蛋白家族,保守结构域由40个左右的氨基酸残基组成.该蛋白家族由许多结构相关、功能不同的调控蛋白组成,在信号转导、蛋白运输和RNA加工等过程中具有重要作用[9].实验室前期分别从龙茭2号正常茭和灰茭中分离出MT型和T型菰黑粉菌,本研究以此为研究材料,通过菰黑粉菌基因组数据分析发现,菰黑粉菌存在一个具有7个WD40结构域的基因,并经PCR克隆后获得了候选基因的基因组序列和CDS序列.经系统进化树分析及对WD40保守结构域进行同源性比对分析,发现该候选基因与玉米瘤黑粉菌Rak1的同源性最高,故命名为UeRak1.MT型和T型菰黑粉菌融合生长试验显示:MT型在细胞融合及菌丝生长能力上均弱于T型.荧光定量PCR检测表明:在细胞融合时期及菌丝生长初期UeRak1的表达量急剧上升,在菌丝大量生长后UeRak1的表达量又有所下降,同时结果显示,在细胞融合生长过程中,T型菰黑粉菌中UeRak1的表达量是MT型的2倍以上.结合MT型较弱的细胞融合生长能力,我们推测UeRak1基因与菰黑粉菌细胞融合和菌丝生长有关.该结果有助于深入研究菰黑粉菌的二型态转化.

1　材料方法

1.1　菌株及培养条件

以分离自龙茭2号正常茭和灰茭的MT-1和T-1菌株为试验菌株,在YEPS培养基(酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、蔗糖20 g/L,琼脂糖15 g/L)中划线培养,培养温度为28 ℃.

1.2　UeRak1基因的克隆及分析

将培养的菰黑粉菌在液氮中充分研磨,按照Trizol试剂说明书提供的方法提取菰黑粉菌总RNA,采用PrimeScriptRT regent Kit With gDNAEraser反转录试剂盒合成菰黑粉菌总RNA的cDNA第一链.根据已有基因组数据信息设计引物UeRak1-F1、UeRak1-R1(表1),通过普通PCR扩增、琼脂糖凝胶回收获得目标片段.将目标片段连接PMD19-T载体转入大肠杆菌,挑取转化子送测序确认.通过NCBI的CDD数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)预测该序列结构.按照CTAB的方法提取菰黑粉菌DNA.再按照UeRak1基因序列设计特异引物UeRak1-F2、UeRak1-R2以菰黑粉菌基因组DNA为模板获得UeRak1目的基因.

1.3　融合试验

将固体培养的菰黑粉菌接种到YEPS液体培养基,180 r/min、28 ℃培养至菌含量OD600为1.0左右.5 000 r/min离心5 min后收集菌体并以YEPS液体培养基稀释成菌含量为2.0,分别将T-1型和MT-1型中的一对性亲和菰黑粉菌1∶1混合后,滴加在YEPS固体培养基上,28 ℃培养,此时为0 h.此后每隔12 h观察取样,至60 h.实验进行3次重复.

1.4　荧光实时定量PCR检测基因的相对表达量

将融合试验的样本提取菰黑粉菌总RNA并反转录成cDNA,方法参考2.2.按照实时定量PCR的引物设计要求设计相关引物(表1).以菰黑粉菌β-actin基因作为内参.qPCR采用20 μL体系,以SYBR Green为染料,使用StepOneTMReal-Time PCR System(ABI)进行qPCR反应.PCR反应体系为:10 μL SYBR Premix Ex TaqTM,0.5 μL Primer(10 μM),0.5 μL cDNA模板,加DEPC水至总体积为20 μL.反应程序为95℃ 30 s;95 ℃ 30 s,54 ℃ 20 s,72 ℃30 s,循环40次,每个样品做3管重复.综合考量标准曲线和Ct值,采用2-ΔΔCt法计算UeRak1基因的相对表达量.

表1　实验相关引物列表

2　结果与分析

2.1　菰黑粉菌UeRak1基因的克隆及序列分析

前期研究表明玉米瘤黑粉菌中存在一个含有WD40-重复序列的蛋白Rak1,在细胞融合和生长中起着重要作用.近期,我们完成了菰黑粉菌的基因组测序工作,在分析过程中预测菰黑粉菌中可能也存在一个编码WD40-重复蛋白的基因.如图1，根据基因组预测序列我们设计了特异性引物UeRak1-F1、UeRak1-R1,扩增得到菰黑粉菌中一段2 388 bp左右的基因组序列,确认了基因组中存在该预测序列.接下来,我们根据基因片段测序结果和结构预测设计开放阅读框引物Uegpa3-F2和Uegpa3-R2对基因组DNA进行扩增,克隆得到1 994 bp的基因组序列,以引物Uegpa3-F2和Uegpa3-R2对cDNA进行扩增,获得1 020 bp的CDS序列,经测序验证,CDD数据库比对确认为完整序列.将基因组序列和CDS序列比对后发现,该基因存在1个大小为974 bp的内含子.

1—2388 bp长度的基因组DNA扩增片段;2—完整的UeRak1基因序列,1 994 bp长度的基因组DNA扩增片段;3—1 020 bp长度的cDNA扩增片段.M-DNA Maker (DL2000 DNA Maker, Takara);箭头所指的都是测序的条带.图1　UeRak1cDNA和基因组片段扩增琼脂凝胶电泳Figure 1　Agarose gel electrophoresis of the UeRak1 cDNA and genomic fragments

经ExPasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测,该基因编码339个氨基酸,蛋白相对分子质量约为37.47 kDa,理论等电点为6.38.通过NCBI中的BLAST比对发现,该基因编码的蛋白与其他真菌中的Gβ亚基及其相似结构的同源性极高,尤其是玉米黑粉菌的Rak1蛋白,因此我们将该基因命名为UeRak1(GenBank登录号KT343767).

2.2　UeRak1蛋白结构及系统发育分析

通过对UeRak1蛋白保守结构域进行预测分析,结果表明该蛋白具有典型的WD40-重复结构域(7个WD40重复序列)和精氨酸-HDAC-超家族结构域(图2),与G蛋白β亚基物同源.很多真核蛋白都具有WD40结构域,该结构域含有7个叶状的β螺旋结构,在生命过程中起着重要的作用,例如RACK1是哺乳类细胞中普遍存在的一种骨架蛋白,是蛋白激酶C受体,也存在保守的WD40结构域,该β-螺旋桨结构的支架蛋白具有整合不同信号通路集成输出的作用,并通过调控核糖体的聚集来影响蛋白翻译过程[9-11].在真菌中也存在RACK1同源物,比如粟酒裂殖酵母中的CPC2[12](SchizosaccharomycespombeCAB11079.1)、酿酒酵母中的ASC1[13](SaccharomycescerevisiaeAJT01249.1)和玉米瘤黑粉菌中的Rak1蛋白[8](UstilagomaydisXP_011388829.1),已有研究表明,它们不仅与真菌的有性生殖有关,与真菌的菌丝生长和致病性等也存在密切的联系.精氨酸-HDAC-超家族则在不同细胞生命过程中起着重要作用,包括细胞周期调控、细胞因子信号转导等.基于此,我们将该氨基酸序列与其它真菌中Gβ亚基、Gβ亚基同源物RACK1及RACK1同源物CPC2、ASC1和Rak1的氨基酸序列通过MEGA6软件采用近邻法构建系统进化树,结果发现菰黑粉菌中UeRak1蛋白与玉米丝黑穗病菌(SporisoriumreilianumSRZ2 CBQ71151.1)、宾地瘤黑粉菌(Melanopsichiumpennsylvanicum4 CDI55376.1)、担子类酵母菌(PseudozymabrasiliensisEST05924.1)和大麦坚黑粉菌(UstilagohordeiCCF48119.1)中的CPC2蛋白及玉米瘤黑粉菌中的Rak1蛋白聚为一个分支,说明与其亲缘关系最近.而与酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、花药黑粉菌(MicrobotryumviolaceumKDE05309.1)等真菌中的Gβ蛋白或Gβ亚基同源CPC2及果蝇(DrosophilayakubaXP_002087998.1)和人(HomosapiensNP_006089)中的具有WD40结构域的RACK1蛋白的亲缘性较远(图3).进一步通过DNAMAN软件对菰黑粉菌及与其亲缘关系较近的四种真菌中的Gβ同源物CPC2和Rak1氨基酸序列中保守结构域进行比对分析,如图4结果显示:WD40重复序列结构域(7-309)在不同真菌中的保守性极高,相似度也较高,仅少数几个位点的氨基酸不同,表明菰黑粉菌中该蛋白可能也参与真菌的菌丝生长、致病性和有性生殖的过程.

图2　UeRak1保守结构域示意图Figure 2　The blast result of conserved domain in UeRak1

图3　UeRak1系统进化分析Figure 3　Phylogenetic analysis of UeRak1

图4　UeRak1与其它真菌中的WD40结构域多序列比对Figure 4　Putative amino sequence alignment with the WD40 domain of UeRak1 with its homologs

2.3　UeRak1基因与菌丝的形成有关

A-0 h;B-12 h;C-24h;D-36 h图5　不同培养时间下菰黑粉菌中UeRak1基因的差异表达分析Figure 5　Differential expression analysis of UeRak1 gene during different growth time

前期研究发现,MT型和T型菰黑粉菌在细胞体外融合生长中存在差异性,表现为在同等试验条件下,MT型的细胞融合生长更少更慢，如图5.本研究选取了分别分分离自正常茭的MT-1和灰茭T-1中的一对性亲和单倍体菌株,在融合试验前单倍体菌株呈酵母形态,(图6A,0 h),后期细胞开始融合(图6B,12 h),后形成双核菌丝(图6C,24 h),最后菌转为菌丝型生长,形成白色气生菌丝(图6D,36 h).运用实时荧光定量PCR,分别在0、12、24、36、48、60、h检测UeRak1的表达变化情况,如图5.结果显示:菰黑粉菌MT-1和T-1中UeRak1的表达趋势基本没有差别;在细胞融合生长期(0-24 h,图6B,C),UeRak1的表达量急剧升高;当融合培养36 h后,气生菌丝开始生长(图6D),此时表达量开始下降.而MT-1菌株中UeRak1基因的表达量均不到T-1菌株的一半.综合分析不同培养时间和不同菌落形态下UeRak1基因的相对表达量差异,推测UeRak1基因与菰黑粉菌细胞融合和菌丝生长具有紧密的联系.

图6　融合试验后菰黑粉菌细胞形态(上)和菌落型态图(下)Figure 6　Morphology of cells and colonis after cell fusion of Ustilago esculenta

3　讨　论

茭白是中国长江流域及以南地区颇受喜爱的一种水生蔬菜,因其肉质鲜美、营养丰富、具有一定药用价值,因此是我国南方一种重要的经济作物.前期众多研究表明茭白植株中存在一种共生菌——菰黑粉菌,它参与茭白植株可食用肉质茎的形成,研究发现在茭白膨大初期就可检测到菌丝的存在,并随着茭白的膨大形成菌丝簇[1,3].已有研究表明,真菌的致病性与它的菌丝的生长状态有着密切得联系,如酿酒酵母与玉米瘤黑粉菌[13-14],所以研究菰黑粉菌从酵母型向菌丝型的转变过程对阐明菰黑粉菌侵染茭白植株的意义重大.大量研究表明,菰黑粉菌与玉米瘤黑粉菌亲缘关系较近,在玉米瘤黑粉菌的酵母型向菌丝型完成转变后,可以侵入植株并通过吸收宿主的养分来完成有性生殖过程,且在该过程中MAPK和cAMP/PKA信号途径具有重要的调节作用[6-7].在玉米瘤黑粉菌中发现,Rak1作为MAPK和cAMP/PKA信号途径的附加组件,参与细胞融合生长和致病性过程[8].本文第一次克隆到了菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1;结构分析表明UeRak1具有7个重复的WD40结构域,是CPC2/ASC1的同源物;表达分析显示,UeRak1可能参与菰黑粉菌从酵母型向菌丝型转变的过程.

本研究基于全基因组测序结果成功扩增出一段2388 bp序列,丰富了菰黑粉菌基因库.经结构分析发现UeRak1与其它真菌中的WD40-重复蛋白具有极高的相似度,且WD40结构域同源性在96%以上(图4),表明该基因在物种间相对比较保守,与已有研究结果类似,即WD-重复蛋白是一个具有高度保守的WD序列但是功能各异的蛋白大家族.而且虽然已经克隆出很多编码WD-重复蛋白的基因,但是大部分WD-重复蛋白的功能和调控机理都还不清楚.对菰黑粉菌中该基因的克隆鉴定及后续的功能研究,不但能更好地了解该基因在菰黑粉菌中的作用,也能更好地了解和掌握WD-重复蛋白家族的性质和功能.

在菰黑粉菌融合试验中,0～24 h为性亲和单倍体细胞融合生长的时间段,培养36 h后开始有较明显的菌丝生长,而MT-1型菰黑粉菌融合生长的细胞数量及菌丝生长速度均少于T-1型(图6).实时荧光定量PCR结果显示UeRak1在12 h和24 h时表达量最高,之后就开始下降(图5).与其生长状态比对后,我们推测UeRak1是细胞融合生长所必须的.

在玉米瘤黑粉菌中,cAMP/PKA和MAPK信号途径分别参与调控真菌的芽殖和细胞延伸过程,两个信号途径协同调控a、b基因及prf1,从而调控真菌的融合生长及致病性[15-17].其中,具有7个WD40重复序列保守域的Rak1蛋白缺失菌株中,prf1、a基因的表达量下调[8].本研究克隆得到的UeRak1基因与玉米瘤黑粉菌具有92%的相似度,它们的WD40保守序列具有99.7%的相似度(图4),说明UeRak1与Rak1极有可能具有相似的功能.荧光定量PCR的研究结果也表明UeRak1基因可能参与菰黑粉菌酵母型向菌丝型转变的过程.该研究结果预示着UeRak1蛋白可能参与菰黑粉菌的细胞融合生长等过程.因此,有必要进一步对UeRak1与cAMP/PKA和MAPK信号途径的联系进行研究,进而阐述UeRak1基因在菰黑粉菌菌丝融合生长及致病性中的作用及其机制.