龙牙肝泰胶囊抗肝纤维化的药效学研究

张玉昆，冯月男，卞敬琦，迟文成，隋雨桐，姜广坤，牛雯颖，姜庆辉，李陆军*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江　哈尔滨　150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江　哈尔滨　150040)

肝纤维化是诸多致病因素导致肝细胞发生坏死、凋亡及炎症反应时，肝内纤维结缔组织异常增生与沉积的病理过程，是慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向肝纤维化发展的主要中间环节[1]。当前研究结果认为,肝炎病毒、血吸虫感染、酒精损伤、药物代谢、胆汁淤积、化学中毒、代谢障碍等均可引起肝纤维化。大量研究表明，肝星状细胞(HSC)的活化与细胞外基质(ECM)代谢失衡是肝纤维化的重要机制，已经证实ECM来源于HSC，HSC活化后分泌大量ECM，造成ECM代谢失衡，进而形成肝纤维化。

龙牙楤木又名辽东楤木，为五加科植物龙牙楤木[Araliaelata(Miq.)Seem.]的干燥根皮及茎皮[2]。龙牙肝泰胶囊是将龙牙楤木根、茎皮粉碎成粗粉，加90%乙醇加热回流提取等工艺制成的胶囊剂，龙牙肝泰胶囊作为纯中药制剂，上市近15年，患者群累计超过500万人。对患者群用药效果进行统计分析发现，龙牙肝泰胶囊对病毒性肝损伤、酒精性肝损伤有显著的保肝护肝作用，对脂肪肝、肝纤维化、肝腹水等病症与其他药物配合使用有明显的治疗改善作用[3-4]。本实验旨在观察肝纤维化模型大鼠血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、肝组织病理组织学检查的改变以及肝脏组织中金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)、基质金属蛋白酶(MMP-1)水平,探讨龙牙肝泰胶囊抗肝纤维化的作用机制，为临床用药提供指导。

1　材料与仪器

1.1　药品与试剂

葵花护肝片(阳性对照药物，黑龙江葵花药业股份有限公司)；龙牙肝泰胶囊(实验受试药物，黑龙江久久药业有限责任公司)；AST、ALT测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；大鼠血清HA、LN、CⅣ和PCⅢ酶联免疫试剂盒(南京安培化工科技有限公司)；TIMP-1、MMP-1试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；四氯化碳(CCl4,分析纯，沈阳化学试剂厂)。

1.2　实验动物

SD雄性大鼠，体质量160～180 g，室温饲养，自由进食。由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心(黑龙江中医药大学GLP)提供，动物合格证编号：SCXK(黑)200804001。

1.3　实验仪器

分析天平(梅特勒)；魅力2000全自动生化分析仪；博塞全自动酶标仪；moticam 3000显微摄影成像系统(美国motic公司)；Image-pro plus6.0病理图像分析系统。

2　实验方法

2.1　实验分组

取SD大鼠60只，按体质量随机分为龙牙肝泰胶囊高、中、低剂量组，正常对照组(空白组)，纤维化组(模型组)，葵花护肝片对照组(阳对组)，每组10只，共6组。

2.2　模型建立与给药方案

每日上午8时左右，除空白组外，其余各组动物，按1 ml/kg体质量灌胃给予油剂CCl4，将CCl4与橄榄油等比例混合配成50%的油剂CCl4，每周灌胃2次，每周称重，按体质量调整给药剂量；空白组按1 ml/kg体质量灌胃给予橄榄油，持续8周。每日下午15时左右给予药物干预，每周5次，持续8周。各组给药剂量分别为：低剂量组42 mg/kg，中剂量组84 mg/kg，高剂量组168 mg/kg，阳对组545 mg/kg；模型组与空白组动物按10 ml/kg体质量给予生理盐水。

2.3　指标检测

末次给药2 h后，乙醚麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心制备血清，测定血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平,取肝脏组织部分液氮冷冻(-70℃保存),测定TIMP-1、MMP-1水平，另一部分用10%福尔马林固定进行病理学检查。

2.4　统计学处理

采用SPSS16.0软件对各组数据结果进行t检验，结果用均值加减标准差的形式表示，P≤0.05表示具有统计学差异。

3　结果

3.1　龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠肝功能的影响

实验结果表明,模型组与空白组比较，大鼠血清中AST、ALT水平极显著性升高(P<0.01)；龙牙肝泰胶囊各剂量组、阳对组与模型组比较，血清中AST、ALT水平均极显著性降低(P<0.01)。结果见表1。

表1　龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠血清中AST、ALT水平的影响

注：与模型组比较，P<0.01；与空白组比较，P<0.01

3.2　龙牙肝泰胶囊对大鼠血清中肝纤维化标志物的影响

实验结果表明，模型组与空白组比较，血清中肝纤维化标志物中HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平均极显著性升高(P<0.01)。与模型组比较，高剂量组、阳对组，能极显著性降低肝纤维化大鼠血清中HA、LN、CⅣ水平(P<0.01)，显著性降低PCⅢ水平(P<0.05)；中剂量组能极显著性降低肝纤维化大鼠血清中HA水平，显著性降低LN、CⅣ水平(P<0.05)，对PCⅢ水平有降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；低剂量组能显著性降低肝纤维化大鼠血清中HA水平(P<0.05)，对LN、CⅣ、PCⅢ水平有降低趋势，但差异无统计学意义。结果见表2。

表2　龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠血清中HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平的影响

注：与模型组比较，P<0.01，P<0.05；与空白组比较，P<0.01

3.3　龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠肝组织中TIMP-1、MMP-1水平的影响

实验结果表明,模型组与空白组比较，大鼠肝脏组织中TIMP-1水平显著性升高(P<0.05)；阳对组、高剂量组与模型组比较,大鼠肝组织中TIMP-1水平显著性降低(P<0.05)；中、低剂量组大鼠肝组织中TIMP-1水平有降低的趋势，但无统计学意义。模型组与空白组比较，大鼠肝脏组织中MMP-1水平极显著性降低(P<0.01)；阳对组与模型组比较,肝纤维化大鼠肝组织中MMP-1水平显著性升高(P<0.05)；高剂量与模型组比较,肝纤维化大鼠肝组织中MMP-1水平极显著性升高(P<0.01)；中、低剂量组与模型组比较,肝纤维化大鼠肝组织中MMP-1水平有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3　龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠肝脏组织中TIMP-1、MMP-1水平的影响

注：与模型组比较，P<0.01,*P<0.05；与空白组比较，P<0.01,△P<0.05

3.4　龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠肝脏组织病理学的影响结果

空白组：细胞排列整齐，界限清晰，细胞核正常，无胞质融合，无纤维化，无炎性细胞，见图1。

模型组：细胞排列紊乱，细胞质与细胞核界限不清晰，细胞核固缩，胞质融合，呈现脂肪变性，局部出现纤维化，呈弥散性病变，散在许多血细胞及炎细胞，见图2。

阳对组：细胞排列基本整齐，细胞核成圆形，肝细胞无变性坏死，少见炎性细胞，见图3。

高剂量组：细胞排列整齐，界限清晰，细胞核呈圆形，无胞质融合，无肝细胞坏死变性，见图4。

中剂量组：细胞排列略有紊乱，胞质见少量融合，胞浆呈疏松，见炎性细胞及变性细胞，见图5。

低剂量组：细胞排列不齐，界限不清，细胞核大多呈圆形，局部纤维化及少量血细胞，见图6。

图1　空白组HE染色图(400×)

图2　模型组HE染色图(400×)

图3　阳对组HE染色图(400×)

图4　高剂量组HE染色图(400×)

图5　中剂量组HE染色图(400×)

图6　低剂量组HE染色图(400×)

4　讨论

肝纤维化是肝脏组织大量胶原沉着富集为特点的病变，多数肝纤维化过程中，都伴随着肝细胞的损伤、变性、坏死等病理改变[5]。CCl4慢性中毒所致肝纤维化与临床肝纤维化形成的过程极为相似，主要包括过氧化反应、肝组织酶的活化、炎症反应等。上述反应均可引起细胞损伤，肝细胞代谢失衡。病生理指标表现为谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平的升高、肝纤维化标志物HA、LN、CⅣ、PCⅢ水平升高等。这一系列性的改变与肝星状细胞(HSC)的活化与细胞外基质(ECM)代谢失衡密切相关。当过量的ECM产生时，会被金属蛋白酶抑制剂(MMP)降解，同时基质金属蛋白酶(TIMP)又能抑制MMP的活性，所以，MMP与TIMP之间的平衡稳定是保护肝细胞正常的前提[6]。

龙牙肝泰胶囊内容物是龙牙楤木醇提物，主要成分是皂苷，水解后的苷元以齐墩果酸为主。研究发现,龙牙楤木醇提物具有抗炎、抗肿瘤、保肝、护肝等药理作用[7-8]。作为纯中药制剂，龙牙肝泰胶囊已在市场销售15年，降酶保肝作用显著，对肝纤维化、脂肪肝、肝硬化疗效显著。本实验通过对肝纤维化大鼠模型肝功能、肝纤维化标志物、病理检查以及肝组织中MMP-1与TIMP等指标的系统性研究可以发现,龙牙肝泰胶囊对肝纤维化大鼠有明显的治疗作用，其作用机制可能与维持肝细胞的稳定性、降低肝细胞损伤、各型胶原的累积、稳定HSC的活化、使金属蛋白抑制剂与基质金属蛋白酶处于动态平衡等相关。肝纤维化致病因素与形成过程还尚未完全明确，故对龙牙肝泰胶囊的药理作用与临床适用证的增加也有待进一步研究探讨。