基于TLR9介导巨噬细胞极化效应探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制

秦合伟，李彦杰，任锟，张志鑫，赵晶，邢若星，原筝

(河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)，河南　郑州　450002)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病最主要的病理改变基础。目前研究认为,AS的发生发展与内皮细胞损伤、脂质紊乱、免疫应答和与其相关的慢性炎症反应密切关系[1-2]。Toll样受体(toll like receptors,TLRs)在天然免疫反应和获得性免疫反应中均具有重要作用，研究表明TLRs与配体结合后迅速二聚化，通过募集大量衔接蛋白而活化受体，启动固有免疫系统，同时也可激活适应性免疫，Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)是TLRs家族中重要的一员，在固有免疫和获得性免疫应答中都具有重要的作用，TLR9可通过影响巨噬细胞的极化状态从而影响AS的形成[3-4]。本研究旨在观察血管软化丸通过对TLR9调控，影响其TLR9下游信号NF-κB和IRF7水平，以及对巨噬细胞(M2/M1)的极化平衡状态的影响，揭示血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制。

1　材料与方法

1.1　细胞与动物

本实验所用小鼠巨噬细胞株RAW264.7均来源于中国科学院上海生命科学研究所。本实验所用C57BL/6J小鼠(中国科学院上海生命科学研究所)12只作为正常组。ApoE-/-小鼠(南京大学模式动物研究所)共48只，SPF级，8周龄，体质量(18±2)g，雄性，随机分为ODN组、IRS组、中剂量组、高剂量组，每组12只。所有动物饲养于河南中医药大学SPF级动物实验中心。

1.2　药物与试剂

血管软化丸组方[5]：山楂30 g，建曲30 g，莱菔子15 g，陈皮12 g，清半夏9 g，茯苓15 g，连翘12 g，郁金12 g，枸杞子15 g，三七12 g，珍珠30 g，代赭石30 g。所用中药均来源于河南省中医院药剂科，通过医院煎药房煎煮和浓缩成不同浓度的汤剂(血管软化丸高剂量：浓度为3.456 g/mL；血管软化丸中剂量：浓度为1.728 g/mL)。

ODN1826和IRS869(上海生工生物工程股份有限公司)；抗体NF-κB p65、NF-κB、TLR9、CD206、MyD88、CD68、IRF7(美国Abcam公司)；抗体iNOS、α-actin(Santa公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；总RNA逆转录试剂盒(Fermentas公司)；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(碧云天公司)；ELISA试剂盒(eBioscience)；其他化学试剂均由河南中医药大学实验中心提供。

1.3　血管软化丸含药血清的制备

SD大鼠20只分为空白组(不用药)和血管软化丸组。空白组给予蒸馏水灌胃，血管软化丸组给予1 g/mL的血管软化丸灌胃，连续灌胃1周后经腹主动脉采血，应用高速离心机12 000 g/min离心，离心后取上清液，56℃温度灭活，-80℃保存备用。

1.4　细胞培养分组及药物血清处理

小鼠巨噬细胞RAW264.7用含10%灭活胎牛血清以及双抗的DMEM高糖培养基，在37℃、5% CO2条件下常规培养瓶内培养，细胞呈贴壁生长，待48 h后更换培养基，细胞用细胞刮传代，待细胞进入对数期时进行实验。当细胞密度长至70%时，换成0.2%低血清培养基培养24 h，然后加相应刺激。实验主要分为对照组(空白血清)、血管软化丸中剂量组、血管软化丸高剂量组、IRS组(TLR9拮抗剂：IRS869)、ODN组(激动剂：ODN1826)。

1.5　Western Blot检测各组RAW264.7细胞TLR9蛋白的表达

收集细胞，PBS洗涤3次，用蛋白裂解液裂解总蛋白，提取蛋白，经定量后，加入缓冲液，加热使蛋白质变性，电泳分离蛋白，转膜至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭，加入相应浓度的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。加入二抗，室温孵育，TBST洗涤3次。用碱磷酶化学发光进行显色。使用ImageJ软件分析条带灰度值[6]。

1.6　巨噬细胞表型的检测

采用免疫荧光双标化学染色检测RAW264.7细胞iNOS和CD206蛋白表达量，具体方法按照说明书步骤进行。

1.7　巨噬细胞相关炎症因子的检测

1.7.1RT-PCR法检测RAW264.7细胞中TNF-α mRNA的含量

巨噬细胞总RNA分离提取，使用Takara反转录试剂盒，将mRNA反转录为cDNA。TNF-α的引物序列为：上游引物5’-ACTCGCCACTCTCGACTCAAG -3’，下游引物5 ’-GACGGTGCCC GAGGCCAGAC-3’；具体方法按说明书步骤进行。采用比较CT值法对样品扩增的CT值进行计算，再按照以下方法计算出各个基因的相对表达量：△CT=目的基因CT-内参CT；△△CT=观察样本△CT-对照样本△CT；样本的相对表达量=2-△△CT。

1.7.2ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清液中TNF-α的浓度

当细胞进入对数期时，刮下细胞，吸管吹匀，种到六孔板中，细胞贴壁12 h后，换成0.2%血清培养基，继续培养24 h，然后刺激干预；留取六孔板中各组的培养基，放到4℃离心机，3 500 rpm离心6 min，将上清用移液枪转移至另一个EP管中以备用。检测具体操作步骤按试剂盒说明书进行，得出各组的OD值。以标准品浓度和相应的OD值为参数，直线回归处理，得出相应的方程，算出各组的浓度。

1.8　体内实验

1.8.1动物造模与灌胃

所有小鼠自由饮水，给于普通饲料饲养1周后分别采用不同饲料饲养，ApoE-/-小鼠采用高脂饲料(含脂肪21%、胆固醇0.15%)饲养。C57BL/6J小鼠12只作为正常组，于饲养4周后将48只ApoE-/-小鼠按照随机分组方法分为4组：IRS组(IRS869，腹腔注射)、ODN组(ODN1826，腹腔注射)、血管软化丸中剂量组(浓度为1.728 g/mL)、血管软化丸高剂量组(浓度为3.456 g/mL)，每组12只，于12周龄起，对照组给予等体积生理盐水灌胃；中药组分别给予血管软化丸高剂量(3.456 g/mL)和血管软化丸中剂量(1.728 g/mL)灌胃。腹腔注射每周2次，灌胃每日1次，连续给药8周后取材进行检测。

1.8.2样品采集与处理

所有要取材动物禁食12 h，采用眼眶取血法采血，按摩心脏部位，用离心管收集血液，低速离心，分离血清，冷冻保存。采血结束后脱颈椎处死，刨腹，分离主动脉(主动脉弓至腹主动脉)，用10%多聚甲醛固定主动脉6 h，主动脉经过乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后切片。

1.8.3病理学切片观察

主动脉经过乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后切片，厚度设定为4 μm，采用常规苏木素-伊红(HE)染色法进行切片染色，应用光学显微镜进行观察[7]。

1.8.4Western Blot法检测斑块TLR9及其下游分子的蛋白表达

检测主动脉斑块中的TLR9(1:500)、MyD88(1:1 000)、NF-κB(1:1 000)、p-NF-κB(1:500)、IRF7(1:1000)、iNOS(1:200)和CD206(1:50)的蛋白相对表达量。具体步骤同细胞的Western Blot法。

1.8.5iNOS和CD206表达的检测

采用免疫荧光双标化学染色检测各组动脉斑块iNOS和CD206的表达，具体方法按照说明书步骤进行。

1.9　统计学处理

2　结果

饲养和灌胃过程中C57BL/6/J小鼠死亡4只(因相互撕咬导致死亡2只，灌胃操作不当导致死亡2只)，ApoE-/-小鼠死亡3只(因相互撕咬导致死亡2只，灌胃操作不当导致死亡3只)，剔除离群值，最后进入统计的各组小鼠数量为10只。

2.1　血管软化丸对TLR9及其下游信号分子蛋白表达水平的影响

2.1.1血管软化丸对RAW264.7细胞和主动脉斑块TLR9蛋白表达水平的影响

药物干预后，ODN组细胞的TLR9蛋白表达水平较对照组明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，各中药组和IRS组细胞的TLR9蛋白表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。结果见表1、图1。

表1　血管软化丸对RAW264.7细胞和主动脉斑块TLR9蛋白表达水平的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与ODN组比较，△P<0.05

图1　各组小鼠TLR9蛋白表达

2.1.2血管软化丸对主动脉斑块TLR9下游信号分子蛋白表达的影响

与对照组相比，ODN组的MyD88、p-NF-κB、IRF7蛋白表达水平相对增加，差异有统计学意义(P<0.05)；各中药组和IRS组细胞的MyD88、p-NF-κB、IRF7蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2、图2。

表2　血管软化丸对主动脉斑块TLR9信号通路下游信号分子蛋白表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与ODN组比较，ΔP<0.05

图2　各组小鼠TLR9蛋白表达

2.2　血管软化丸对巨噬细胞极化状态的影响

2.2.1含药血清和TLR9对巨噬细胞(M2/M1)的极化状态的影响

通过血管软化丸含药血清、TLR9的激动剂和TLR9拮抗剂对RAW264.7细胞进行刺激，观察含药血清和TLR9对巨噬细胞(M2/M1)的极化状态的影响。采用免疫荧光双标染色法检测iNOS和CD206蛋白的表达。

结果表明，ODN1826能够诱导巨噬细胞高表达M1型巨噬细胞标志iNOS，而血管软化丸含药血清和IRS869可以诱导巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞的标志CD206。差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果见图3，表3。

表3　血管软化丸含药血清对巨噬细胞iNOS和CD206免疫荧光阳性比率的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与ODN组比较，ΔP<0.05

2.2.2应用免疫荧光检测各组动脉斑块iNOS和CD206的表达

结果发现，与ODN组相比，各中药组和IRS组斑块中iNOS的荧光密度低表达，而CD206的荧光密度为高表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表4。

图3　含药血清和TLR9对巨噬细胞(M2/M1)极化状态的影响(光学显微镜，200×)注：A：对照组；B：ODN组；C：IRS组；D：中剂量组；E：高剂量组

图4　各组小鼠主动脉病理学改变(光学显微镜，200×)注：1：对照组；2：ODN组；3：IRS组；4：中剂量组；5：高剂量组

组别niNOSCD206对照组100.51±0.060.51±0.06ODN组100.75±0.08*0.11±0.02*IRS组100.32±0.04*Δ0.26±0.04*Δ中剂量组100.45±0.04*Δ0.29±0.03*Δ高剂量组100.42±0.07*Δ0.28±0.03*Δ

注：与对照组比较，*P<0.05；与ODN组比较，ΔP<0.05

2.3　血管软化丸对巨噬细胞(M1/M2)相关炎症因子的影响

通过血管软化丸含药血清和TLR9的激动剂与拮抗剂来干预RAW264.7细胞24 h后，RT-PCR法检测。结果显示，与对照组相比，ODN组的TNF-α mRNA表达明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与ODN组比较，各中药组和IRS组TNF-α mRNA表达明显较低，差异有统计学意义(P<0.05)。

用ELISA法检测各组培养基中TNF-α的浓度(pg/ml)。结果显示，与对照组相比，ODN组的TNF-α mRNA表达明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与ODN组比较，各中药组和IRS组TNF-α mRNA表达明显较低，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表5。

2.4　各组小鼠主动脉病理形态观察

在光学显微镜下发现:1)正常组：小鼠主动脉壁厚薄均匀，主动脉内膜光滑平整，内膜各层结构正常，未发现明显的动脉粥样硬化病灶。2)ODN组：小鼠主动脉管腔不平，主动脉内膜明显增厚；可发现明显的动脉粥样斑块。3)IRS组和中药组：主动脉壁各层结构正常，局部可见小灶性的钙化颗粒物沉积，可见较小斑块，病变程度明显较轻。结果见图3。

表5　血管软化丸对巨噬细胞相关炎症因子TNF-α的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与ODN组比较，△P<0.05

3　讨论

动脉粥样硬化作为心脑血管疾病最常见和最基本的病理改变，是一个长期综合性的病理过程，动脉粥样硬化病理机制尚未十分明确，一般认为与患者脂代谢异常、高血压、糖尿病和吸烟等因素有关。关于动脉粥样硬化的发病机制，有脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说、炎症反应学说、免疫细胞(巨噬细胞、T细胞和肥大细胞等)浸润、LDL受体缺失学说、损伤应答学说、剪切应力学说等。巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块中最典型的炎症细胞，参与了动脉粥样硬化的发生发展。巨噬细胞可活化为2种不同的亚型：M1型和M2型。M1型是经典激活型，具有促炎作用；M2型是替代激活型，具有抗炎作用[8]，巨噬细胞的功能由极化状态(M1/M2)决定。研究发现,动脉粥样硬化与心外膜脂肪组织中的巨噬细胞极化状态有密切关系[9]，巨噬细胞通过上调其TLRs表达影响巨噬细胞活化表型[10-11]。TLR9是哺乳动物细胞内的一种重要的模式识别受体，主要分布于巨噬细胞、血液中的B细胞和树突状细胞等免疫细胞。IRS作为一类免疫调节DNA序列，能够有效抑制TLR9的激活[12]。ISS可通过激活TLR9进而引起Thl/ Th2类细胞因子的平衡偏离[13]，所以TLR9表达水平的改变可能与巨噬细胞的极化状态存在一定的相关性。近年来，中医药在防治动脉粥样硬化的研究中取得了一定的进展，然而对中医药防治动脉粥样硬化的具体作用机制还不十分明确。

中医学认为，大多数慢性病患病日久，往往逐渐出现血瘀之症，即“久病必瘀”，其“瘀”可以为血瘀亦可为痰瘀互结,追其源流，古人早有论述。《素问痹论》指出：“病久入深，营卫行涩，经络失疏故不同。”朱丹溪曰:“久病必瘀”，叶天士曰:“大凡经主气，以络主血，久病血瘀”。当今社会，民食多以甘美，待客多饮酒酿，嗜烟草者众，“饮食自倍，脾胃乃伤”，加之劳心思虑，郁怒在所难免，因此病多虚中挟实，治病不宜纯补，宜“寓补于消，以消代补”，消者去其雍也。结合中医基础理论和临床研究，我们认为痰瘀阻滞是动脉粥样硬化的主要证型，李鲤教授创立“血管软化丸”即有此意。血管软化丸[5]由山楂、建曲、莱菔子、陈皮、清半夏、茯苓、连翘、郁金、枸杞子、三七、珍珠、代赭石组成。方中山楂消食导滞为君药；神曲消食健胃祛除酒食陈腐之积；莱菔子长于下气除胀，消食除积；半夏和茯苓健脾除湿化痰；郁金、三七解郁行气，化瘀散结；枸杞滋补肝肾以固本；珍珠母和代赭石平肝潜阳，降逆祛痰，共为臣药；陈皮理气和中为佐药；甘草调和诸药为使。诸药合用，共奏消积化痰，活血化瘀，平肝潜阳之功。

本实验旨在观察血管软化丸通过对TLR9调控，影响其TLR9下游信号NF-κB和IRF7水平，以及对巨噬细胞(M2/M1)极化平衡状态的影响，从分子、细胞和组织等多层次多靶点揭示中药复方血管软化丸防治AS的分子机制。研究结果显示,在血管软化丸作用下，与对照组RAW264.7细胞相比，中药组TLR9蛋白表达量明显下降，动脉斑块的TLR9、MyD88、p-NF-κB和IRF7蛋白表达量均明显降低。ODN组M1型巨噬细胞比例相对增加，各中药组和IRS组M2型比例相对增加。各中药组和IRS组动脉斑块的CD206/iNOS比值相对增加，斑块M1型巨噬细胞相关炎症因子(IL-1β,iNOS,Ciita)表达相对降低，M2型相关炎症因子(Ym1,Fizz1)表达相对升高。在RAW264.7细胞实验中，中药和IRS可逆转ODN1826引起的TNF-α的升高，使其降低。同时，各中药组斑块形成和面积相对较少，血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用得到验证。以上研究表明，血管软化丸和TLR9的拮抗剂IRS869可抑制TLR9的表达，阻止其下游信号NF-κB和IRF7的激活，进而改变巨噬细胞极化状态(M2/M1)的平衡使其向M2型方向倾斜，抑制动脉粥样硬化的发生发展，我们推测这是血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制之一。