皮肤鳞状细胞癌的基因表达及信号传导通路的生物信息学分析

陆晓鸥　宗兴燕　王璐　陈宏泉

[摘要]目的通过对皮肤鳞状细胞癌（cSCC）基因表达的数据分析找到异常表达的基因群，明确这些差异基因的功能、参与的信号传导通路，并找出具有标志性功能的枢纽基因，进一步探讨cSCC的分子机制。

方法从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中下载GSE66359的基因表达数据，对差异基因进行基因本体论（GO）分析和基于京都基因和基因组数据库的通路分析（KEGG通路分析），并应用Cytoscape软件构建差异基因产物的蛋白質相互作用（PPI）网络，筛选枢纽基因。

结果该cSCC基因芯片数据中共有894个差异基因，其中438个上调基因，456个下调基因。GO分析显示上调基因主要富集的生物进程为：有丝分裂细胞周期过程，染色体分离；下调基因：角质形成细胞分化。KEGG分析显示，上调基因主要富集的信号通路：DNA复制、细胞周期；下调基因：MAPK信号通路、Notch信号通路。通过构建PPI网络得到了前10位枢纽基因SHC1、AURKB、SMC4、PLK1、PCNA、PTTG1、BRCA1、MCM2、EphB2、HDAC，这些基因参与3条重要通路，包括细胞周期、DNA复制和蛋白酶体。

结论SHC1、AURKB、SMC4等基因的变异导致染色体、有丝分裂、细胞周期及MAPK、Notch信号通路的异常可能参与cSCC的发生及进展过程。

[关键词]肿瘤，鳞状细胞；皮肤；信号转导；微阵列分析；生物标志物

[中图分类号]R751

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02021007

皮肤鳞状细胞癌（cSCC）是发生于表皮上皮细胞的一种恶性肿瘤，其病因复杂，紫外线照射、热辐射损伤、化学致癌物、病毒感染及某些慢性皮肤病等均是其致病因素。白种人cSCC是非黑色素性皮肤肿瘤中仅次于基底细胞癌（BCC）的第二大皮肤肿瘤，与BCC相比，cSCC具有更强的侵袭性、更高的复发率及转移率，因而其危险性比BCC更大[1]。高天文等[2]研究显示，国内cSCC约占所有皮肤恶性肿瘤的29.4%，略高于BCC（28.0%），其中cSCC的确诊病例数以每年2.6%的比例逐年上升。由于目前对cSCC发生的分子机制认识不清，cSCC早期诊断及治疗效果均不理想。基因芯片是一种高通量基

2期

陆晓鸥，等. 皮肤鳞状细胞癌的基因表达及信号传导通路的生物信息学分析

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因表达分析平台，近年来在差异基因筛选、疾病与基因表达的关系、疾病的分子诊断、新药开发等领域得到广泛应用。在cSCC的研究中应用基因芯片技术发现了成百上千个差异基因，也发现了其中部分基因在某些生物进程中的作用。然而仅分析某个差异基因有其局限性，不能全面地分析差异基因间的相互作用，应用基因芯片技术联合生物信息学方法能够更全面地分析cSCC中基因的差异性表达，充分挖掘原始研究中有价值的信息[3]。FARSHCHIAN等[4]收集了cSCC细胞样本和正常表皮角质形成细胞样本进行差异基因分析。本文研究从高通量基因表达（GEO）数据库中下载其原始数据（GSE663

59）进行分析，首先通过比较cSCC细胞和正常表皮角质形成细胞的基因表达谱筛选出差异基因，然后对差异基因进行基因功能注释分析和信号传导通路富集分析，并找出具有高连通度的枢纽基因，进而从分子水平研究cSCC的发生、进展机制，为cSCC的诊断、靶向药物研究及判断预后提供有价值的信息。

1材料和方法

1.1基因芯片数据

从GEO数据库中下载GSE66359数据，该研究是基于GPL570平台（Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）的芯片，由FARSHCHIAN等[4]发表。GSE66359数据集包含13个样本，其中8个cSCC细胞样本，5个正常人类表皮角质形成细胞样本。

1.2差异基因筛选

用GeneSpring软件（version 14.8，Agilent，USA）对原始数据的TXT文件进行分析，应用分层聚类分析法将原始数据分为cSCC组和正常人类表皮组。使用GeneSpring软件中的主要成分分析（PCA）控制探针质量，探针强度值低于20%的数据被排除。用经典t检验筛选表达变化在2倍以上的差异基因，以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.3差异基因的基因本体论（GO）分析和通路分析

GO分析是进行基因和基因产物注释及鉴别高通量基因组和转录组特有生物学属性的常用方法。京都基因和基因组数据库（KEGG）可以对基因功能和有高位功能信息的相耦合基因组进行系统分析。在DAVID数据库中对基因进行相关的生物学注释是成功的高通量基因功能分析的关键基础。本研究应用DAVID中的在线工具对差异基因进行GO分析和KEGG分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.4蛋白相互作用（PPI）网络整合及模块分析

STRING数据库是分析评价蛋白质相互作用信息的在线工具，该数据库涵盖了来自于1 133种生物的5 214 234种蛋白。为评价差异基因编码的蛋白质间的相互作用关系，将筛选出的差异基因输入到STRING中，只有实验证实的相互作用综合得分>0.4的蛋白质才被认为有统计学意义。用Cytoscape软件构建PPI网络图，并用MCODE（molecular complex detection algorithm）插件进行扫描，

有意义的PPI模块筛选标准为：MCODE得分>3，网络节点数>4。

对筛选出的模块中的差异基因再进行功能和通路富集分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1筛选差异表达基因

用GeneSpring软件对FARSHCHIAN等[4]收集的8个疾病样本和5个正常样本原始数据进行分析，以P<0.05、倍数变化（FC）>2.0为标准筛选差异基因，共筛选出894个差异基因，其中上调基因438个，下调基因456个。前50位上调基因和下调基因用热图表示，见图1。

2.2GO分析

GO分析显示上调基因主要富集的生物进程（BP）：有丝分裂细胞周期过程，染色体分离，有丝分裂核分裂；下调基因主要富集的BP：角质形成细胞分化。上调基因主要富集的分子功能（MF）：DNA解旋酶活性，染色质结合，DNA复制起始结合；下调基因主要富集的MF：MAP激酶酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，生長因子受体结合，MAP激酶磷酸酶活性。上调基因主要富集的细胞成分（CC）：染色体的一部分，核质，稠密染色体；下调基因主要富集的CC：编码角质化包膜，胞外区，胞囊。见表1。

2.3KEGG信号通路分析

得到了上调基因和下调基因富集的主要信号通路，上调基因主要富集的信号通路包括DNA复制、细胞周期、错配修复、蛋白酶体、Fanconi贫血通路；下调基因主要富集的信号通路包括MAPK信号通路、腹背轴的形成、Notch信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢、轴突导向。见表2。

2.4蛋白质PPI分析

基于STRING数据库筛选出10个最具代表性的枢纽节点如下：Src homology 2 domaincontaining

3讨论

cSCC具有转移至人体任何器官的能力，从预后来讲cSCC转移是致命的。已有研究表明，转移性cSCC致死率超过70%，因此对于转移性cSCC的治疗是困难的[5]。因此，cSCC发病的分子机制研究对其的诊断、治疗及预后有非常重要的意义。本研究从GEO数据库中下载了GSE66359数据，该数据是基于对正常角质形成细胞和cSCC细胞的基因表达谱的分析而形成的数据集，通过对比分析该基因芯片的原始数据得到的差异基因能够为后续各种有意义的分析提供可靠的依据。

本研究应用生物信息学分析方法确定了cSCC和正常对照组间具有表达差异的基因894个，包括438个上调基因和456个下调基因，应用GO分析和KEGG分析方法探讨了差异基因的功能。GO分析显示，上调的差异基因富集的细胞成分主要是染色体，具体在着丝粒区，通过调节DNA解旋酶活性、DNA复制参与有丝分裂细胞周期过程，包括核分裂、染色单体分离及细胞周期各时相的变化；下调的差异基因主要参与角质形成细胞分化。由此可以看出，差异基因主要影响细胞的有丝分裂。研究证实，细胞周期及细胞增殖的失调是cSCC发生及进展的重要机制，p53等细胞周期调节分子的突变是参与癌变的重要因素[6]；细胞周期蛋白D1作为重要的细胞周期调节因子在cSCC中表达增高，在表皮细胞癌变过程中主要引起细胞增殖而导致cSCC的发生[7]。KEGG信号通路分析显示，上调差异基因主要富集的信号通路包括DNA复制、细胞周期、错配修复及Fanconi贫血通路。已有研究表明，与细胞周期相关的基因突变与cSCC的转移性有密切的联系[8]。DNA复制出现变异与cSCC的分化程度有密切联系，MCM蛋白是一系列调控DNA复制的蛋白质，是细胞增殖的特异性指标，在高分化和低分化的cSCC中，MCM蛋白的表达有显著差异，说明DNA复制对cSCC的表型及预后有重要影响[9]。

错配修复基因在DNA复制中发挥着重要作用，这些基因突变可能导致异常短的或失活的蛋白质产生而引起细胞癌变[10]；错配修复的双等位基因失活（MSH2或MLH1）可导致肿瘤的恶性转化。本文结果显示，与正常对照组织比较cSCC样本MSH2表达明显升高，说明错配修复基因参与cSCC的发生[11]。Fanconi贫血是一种罕见的隐性遗传性疾病，由编码贫血通路的15个基因中的1个基因突变引起，Fanconi贫血病人有患头面部SCC的极端风险，有明显鳞状细胞癌的易感性[12]，Fanconi贫血的突变基因可能参与cSCC的发生过程，具体基因及通路有待进一步探讨。下调基因主要与MAPK信号传导通路及Notch信号通路有关，MAPK信号传导通路在日光性角化（AK）向cSCC的转化过程中起重要作用，因此作为预防cSCC的潜在靶点在调节肿瘤细胞增生及存活的过程中起主要作用[13]。已知Notch信号通路可维持干细胞功能或诱导潜在的癌症起始细胞终末分化，在调节组织发育和自我更新过程中发挥作用[1416]。Notch通路在癌症的发展中起抑制作用。有研究结果显示，阳光暴露部位的浸润性cSCC的Notch1表达下调[17]，长期紫外线照射引起MAPK及Notch信号通路的抑制，可能导致cSCC发生。

本研究对差异基因进行了PPI网络构建，筛选出10个最具代表性的枢纽基因：SHC1、AURKB、SMC4、PLK1、PCNA、PTTG1、BRCA1、MCM2、EphB2、HDAC。①PPI分析结果显示，SHC1是连通度最高的枢纽基因，说明该基因与cSCC的发生及进展关系最为密切，可能是本病潜在的生物标志物。已知SHC1基因编码包含SH2和PTB结构域的支架蛋白，参与调节多种细胞功能，如MAPK激活、细胞增殖和凋亡以及肿瘤进展和转移，特别与乳癌的分型及不良预后有关[18]。与正常细胞相比，SHC1在多种肿瘤细胞中均高表达和高磷酸化。SHC1可通过不同磷酸化反应和PPI对表皮生长因子的刺激做出反应，有利于细胞增殖和存活[19]。SHC1是增强癌症细胞对8ClcAMP治疗敏感性的关键，SHC1及其信号网络是该治疗的靶点[20]。胰腺癌中Ⅰ型胶原激活的盘状结构域受体1上调N钙黏着蛋白时需要SHC1辅助[21]，而SHC1在cSCC中的信号通路值得进一步研究。②第2个枢纽基因是AURKB，其编码产物是Aurora激酶家族的一员，属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是CPC（chromosomal passenger complex）的催化组分，可调节细胞G2期到胞质分裂的过程，包括染色单体分离、组蛋白修饰和胞质分裂，AURKB过表达在人类多种恶性肿瘤中被发现[22]，AURKB可磷酸化P53组蛋白，破坏其稳定性，导致有丝分裂异常[23]。③第3个枢纽基因是SMC4，其过表达参与肿瘤细胞的生长、转移及侵袭性，与癌症病人的不良预后有关。SMC4的蛋白表达水平在人类神经胶质瘤细胞中显著增加，并与不良预后相关，SMC4过表达显著促进体外和体内胶质瘤细胞增殖速度和侵袭能力，而SMC4下调时则降低。此外，在SMC4转导的胶质瘤细胞中被激活而在SMC4沉默的胶质瘤细胞中被抑制的转化生长因子β（TGFβ）/Smad信号通路增强了SMC4介导的胶质瘤细胞侵袭性[24]。在人类肝细胞癌组织和细胞系中SMC4高表达，并且SMC4蛋白水平与原发性肝癌的肿瘤大小、分化程度、TNM分期及血管浸润有关。miR219调节肝细胞癌的增殖和侵袭也是通过SMC4实现的，这两个指标呈负相关[25]。④第4个枢纽基因是PLK1，其在cSCC中过表达，并且是cSCC细胞存活所必需的，在多种不同的肿瘤类型中都有相似的表现。与正常增殖的角质形成细胞相比，cSCC角质形成细胞中PLK1基因敲除和抑制可以诱导G1/M期阻滞和凋亡[26]。⑤PCNA为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，与DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标[27]。子宫颈癌组织中CCHE1通过与PCNA的mRNA结合增强PCNA表达，从而发挥促进癌细胞增殖的作用，并且对肿瘤的生长、侵袭及预后产生重大影响[28]。⑥PTTG1在活动性细胞周期中的表达显著增加，提示该基因与细胞增殖的调节有关，并且有研究显示PTTG1通过抑制TGFβ通路促进乳癌细胞生长[31]。角质形成细胞中PTTG1过表达可以通过反向激活cMyc、Cyclin B1和CDK1而导致细胞增殖，cMyc、Cyclin B1及CDK1都与细胞生长及癌变密切相关，提示PTTG1在表皮癌变和向恶性肿瘤转化过程中发挥独特的作用[30]。在cSCC中，PTTG1可能是细胞增殖的潜在标志，其表达水平与P53蛋白突变呈正相关。紫外线照射致p53突变累积，而异常的p53突变使PTTG1基因表达增强，从而导致皮肤肿瘤的恶性转化[31]。⑦BRCA1肿瘤抑制蛋白是几种不同大分子蛋白质复合体的核心成分，有DNA损伤修复作用，执行细胞周期检控

點功能，这种DNA修复蛋白网络能够维持基因组稳定、抑制癌症的发生[32]。BRCA1参与细胞分化、凋亡和DNA重组等重要的生物进程，其突变或异常表达在各种类型的鳞状细胞癌中均被发现。在cSCC中rAd/p53基因治疗能够使BRCA1的表达增加，表明BRCA1是cSCC重要的抑癌基因[33]。⑧MCM2蛋白参与DNA复制和细胞周期的调节，因其与DNA从G1期进入S期有关，所以是细胞增殖的潜在特异性指标，是发育不良、原位癌及浸润性恶性肿瘤的有效标志物。在高分化和低分化的cSCC中MCM2蛋白表达差异有显著性，MCM2蛋白与6 mm厚的cSCC之间有显著联系，MCM2蛋白表达与cSCC的预后密切相关[9]。⑨在cSCC肿瘤细胞中EphB2出现特异性高表达，阻止其表达可以显著抑制cSCC细胞的增殖及转移，Eph信号通路介导细胞接触依赖性细胞排斥作用，可以引导细胞定向移动，抑制EphB2表达能够减低细胞间排斥作用，导致cSCC细胞的定向转移能力缺陷，降低其侵袭性。另外，EphB2调节MMP13和MMP1两种重要侵袭蛋白酶的表达，从而引起cSCC细胞的侵袭及植入组织，EphB2在原位cSCC向侵袭性cSCC转化过程的早期发挥重要作用[4]。⑩HDACs是癌症分子治疗的重要靶点，催化去除组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基的乙酰基。

HDACs对细胞周期进程、细胞增殖及分化都产生重要影响，HDACs也被证明是皮肤肿瘤抑制因子p53和p63的重要调节剂。

综上所述，本研究对cSCC的差异表达基因进行了全面的生物信息学分析。本文结果显示，cSCC中差异基因的基因产物主要富集于染色体，包括稠密染色体着丝粒区；cSCC中差异基因主要参与有丝分裂细胞周期过程、有丝分裂核分裂、姐妹染色单体分离、角质形成细胞分化等生物进程；基因的差异性表达导致DNA解旋酶活性、染色质结合、DNA复制起始结合以及丝氨酸内肽酶抑制剂活性等分子功能的异常也可能与CSCC发病的分子机制有关系。SHC1、AURKB、SMC4等基因的差异性表达导致MAPK、Notch等信号通路的异常，进而影响错配修复、细胞周期、DNA复制和蛋白酶体，可能参与cSCC的发生及进展过程。上述信号传导通路及枢纽基因可能参与cSCC的发生及进展，需要进一步的试验研究加以证实。本研究可为将来cSCC的分子机制、生物标志物及靶向药物的研究提供有价值的信息。今后还需要分子生物学实验来进一步探讨差异基因在cSCC进展中的具体作用机制。

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（本文編辑黄建乡）