医用几丁糖对兔腱骨愈合和肌腱粘连的影响

王晓龙　李肯　李利平　赵夏　翟申浩　于腾波

[摘要]目的探讨医用几丁糖在兔肩袖肌腱修复术后对兔腱骨愈合和肌腱及周围组织粘连的影响。方法挑选18只成年健康雄性新西兰大白兔，建立肩袖损伤动物模型，然后随机分为医用几丁糖组（A组）和生理盐水对照组（B组），每组9只。两组均于冈上肌切断后2周行腱骨缝合，重建冈上肌止点，并按分组进行药物处理。术后6周应用大体解剖观察、肌腱吻合处粘连程度等级评分和组织学检查等方法，系统评价医用几丁糖对腱骨愈合和肌腱及周围组织粘连的影响。

结果术后6周，A组肌腱及周围组织粘连程度轻于B组，差异有统计学意义（H=50.879，P<0.05）；与B组相比，A组软骨细胞增生明显（t=12.408，P<0.05），肌腱处成纤维细胞数量明显减少（t=8.687，P<0.05）。A组无明显脂肪浸润，而B组可见脂肪空泡。A组成纤维细胞排列紧密，排列方向与正常肌腱细胞方向大致相同，其内可见少量新生毛细血管，整体愈合与正常兔肩袖组织较为相似，愈合良好；B组的成纤维母细胞及成纤维细胞排列紊乱无序，无明显毛细血管增生，整体愈合较差。

结论医用几丁糖在促进腱骨愈合的同时，也减少了肌腱及周围组织粘连的发生。

[关键词]几丁糖；回旋套损伤；腱骨愈合；组织粘连；兔

[中图分类号]R684.8

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02016206

肩袖损伤是好发于中老年人的肩关节疾患，其发病率占肩关节疾病的17%～40%[1]，是引起病人肩部疼痛和肩关节活动受限的主要原因。近年来，随着关节镜技术的不断发展，关节镜下肩袖损伤修补术已成为肩袖损伤最主要的治疗方式[2]。但是，肩袖的愈合过程非常复杂，既涉及内源性愈合机制，又涉及外源性愈合机制[3]。在内源性愈合过程中，肌腱细胞增殖并产生细胞外基质；在外源性愈合过程中，肌腱成纤维细胞增生并破坏肌腱末端，虽然这是愈合过程中所必需的，但也会导致肌腱粘连[4]。另外，关节镜下肩袖修补术后6周内病人都要进行肩关节制动，但制动时间长易导致肌肉萎缩和关节粘连[5]。肌腱及周围组织粘连可導致关节僵硬及活动不利，严重影响肩关节术后功能康复。因此，如何预防术后肌腱及周围组织粘连和后期的关节僵硬，

已成为骨外科的重要研究课题之一。迄今为止，国内外针对肩袖修补术后存在的肌腱及周围组织粘连尚未找到比较理想的治疗方法。随着医学研究的迅速发展，发现预防粘连的生物制剂如透明质酸、几丁糖及聚乳酸等可降低术后肌腱及周围组织粘连的发生率[6]。目前大量的实验研究已初步证实，医用几丁糖具有预防或减轻肌腱损伤肌腱吻合后肌腱粘连的作用[710]。既往研究主要关注的是几丁糖在预防或减轻肌腱吻合后肌腱粘连中的作用，而本实验着重研究的是几丁糖对腱骨愈合和肌腱及周围组织粘连的影响。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物骨骼成熟的健康雄性新西兰大耳白兔（由青岛大学实验动物中心提供）18只，3～5月龄，体质量2.5～3.0 kg。单笼普通饲养，术前观察1周确认体健无疾病。

1.1.2主要器械与试剂组织切片机（德国Leica公司）、恒温电热水浴箱（北京医疗设备厂）、光学显微镜（日本OLYMPUS公司）、天平、电子秤；医用几丁糖液体敷料（长沙海润生物有限公司）、水合氯醛、青霉素及制片用制剂。

1.2实验方法

1.2.1兔肩袖损伤模型构建用电子秤称取10 g水合氯醛粉剂，溶于浓度为100 mL灭菌注射用水中，配制成100 g/L水合氯醛溶液。将兔称质量后，以100 g/L水合氯醛溶液按2.5 mL/kg行耳缘静脉注射，麻醉深度为趾蹼反射消失。麻醉成功后将兔固定于兔手术台上，于肩背部及双上肢备皮至足底，然后用碘附消毒，铺洞巾。在肩关节肱骨大结节处做长约2 cm的纵形皮肤切口，切开皮下筋膜，钝性分离三角肌，暴露冈上肌肌腱大结节止点处，然后沿腱骨愈合处锐性切断冈上肌肌腱末端，并在断端肌腱边缘处切除0.5 cm×0.5 cm的肌腱组织形成全层肩袖损伤，将切断的冈上肌肌腱边缘用丝线打结标记，便于后期手术时准确定位（图1A～D）。检查无活动性出血后逐层关闭切口。观察家兔自然苏醒，置单笼兔笼中饲养，患肢不制动。

1.2.2兔肩袖损伤的修复于冈上肌切断后2周行腱骨缝合，重建冈上肌止点；沿原切口暴露冈上肌肌腱造模口，充分松解冈上肌与周围组织的粘连，在大结节表面用骨磋去皮质化处理；用复位巾钳于肱骨大结节处打骨道（图1E），用2号爱惜邦缝线以改良的MasonAllen方式对冈上肌腱行腱骨缝合，将冈上肌拉回缝合于原解剖止点（图1F）。

1.2.3分组及药物处理肩袖损伤模型建立后，将18只兔随机分为医用几丁糖组（A组）和生理盐水对照组（B组），每组9只。A组于肌腱缝合口内及周围用注射器注入医用几丁糖溶液0.2 mL，注射量的标准是在腱鞘内肌腱缝合处均匀注满（图1G），以40丝线逐层缝合肌肉皮肤。B组于肌腱缝合口内及周围用注射器均匀注入生理盐水0.2 mL，以40丝线逐层缝合肌肉皮肤。

1.2.4固定及术后预防感染术后用医用高分子石膏将肘关节固定于屈曲90°位1周（图1H），1周后拆除石膏，正常活动。造模后3 d，肌肉注射青霉素4×105 U预防感染。术后10 d切口拆线，正常饲养。

1.3观察指标

两组兔均于术后6周处死，取实验肌腱标本，首先进行解剖观察，对冈上肌腱吻合处进行粘连等级分级，然后进行组织学检查，并比较两组软骨细胞和成纤维细胞数。

1.3.1解剖观察沿原手术切口切开皮肤筋膜，暴露缝合后的冈上肌腱，观察冈上肌腱周围组织的病理性变化、吻合口周围肌腱颜色、冈上肌腱表面是否光滑、冈上肌腱与周围组织的粘连情况、冈上肌腱的滑动性。肌腱及周围组织粘连程度按照汤锦波的TAM五级评分法[11]进行粘连等级分级。Ⅰ级：肌腱周围无粘连存在，但可以有少量肉芽组织；Ⅱ级：少量膜样、束带状粘连，局限于缝合处，对肌腱滑动基本无影响；Ⅲ级：小块状或宽带状疏松粘连，纤维细长、疏松、质软，肌腱滑动部分受限；Ⅳ级：中等程度粘连，向缝合点远近蔓延，肌腱滑动明显受限或几乎不能滑动；Ⅴ级：致密粘连，肌腱与鞘管壁、皮下紧密相连，不易分离，范围广，肌腱无任何滑动。

1.3.2组织学检查完成粘连等级分级后，迅速切下缝合口周围长约1.5 cm的肌腱组织和骨组织。以40 g/L甲醛溶液浸泡组织标本24 h后进行脱钙处理。脱钙结束以自来水冲洗标本后，清除关节周围软组织，用锐利刀片将标本沿腱骨移行方向纵向切开，修整标本为约1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，脱水、透明、浸蜡、包埋及切片。对石蜡切片进行苏木精伊红（HE）染色，在光学显微镜下进行观察、分析，照相。

选取染色满意的切片，每张切

片随机取5个固定测量窗（测量窗面积10 000 μm），应用计算机系统（Image Pro Plus6）于高倍光镜（100倍）下计数腱骨愈合区域附近1 mm范围内的成纤维细胞及软骨细胞。

1.4统计学分析

应用SPSS 12.0软件进行统计学分析。肌腱及周围组织粘连程度分级数据为有序分类变量且不符合正态分布，两组比较采用H检验；成纤维细胞及软骨细胞数符合正态分布，以[AKx-D]±s形式表示，两组比较采用t检验。以P<0.05为差异有显著意义。

2结果

2.1解剖观察

所有兔术后进食无明显异常，切口均一级愈合。A组肩袖表面可见清亮滑液，有少量瘢痕组织和新鲜肉芽组织增生，色泽红润，肩袖组织与周围组织分离清楚，粘连等级为Ⅰ～Ⅱ级（图2A、B）。B组肩袖组织与周围组织粘连严重，无法明显分离完整清晰肩袖组织，肩袖周围可见大量增生肉芽组织，粘连等级为Ⅳ～Ⅴ级（图2C、D）。术后6周A组肌腱及周围组织粘连程度均轻于B组，差异均有统计学意义（H=50.879，P<0.05）。见表1。

2.2组织学观察

术后6周，与正常兔肩袖相比，A组腱骨愈合处可见大量新生软骨细胞，骨皮质内可见少量破骨细胞及成骨细胞，肌腱处见成纤维母细胞及成纤维细胞，成纤维细胞排列紧密，排列方向与正常肌腱细胞损伤有重要研究意义。目前，用于研究肩袖损伤的模型动物主要有大鼠、兔、犬、羊以及灵长类动物等。兔的肩胛下肌与人类有类似的解剖学和生物力学特性，尤其适用于研究肩袖损伤后的肌腱改变（肌腱及周围组织粘连、脂肪浸润等）[12]；在组织学上，兔肩袖肌腱包括与人类相似的由肌腱到骨的移行区域，可用于腱骨愈合的研究[1213]；兔肩袖的愈合方式与人类的相似[14]；此外，兔肩袖损伤模型还常用来观察各种生长因子、组织工程材料对肩袖损伤的治疗效果[1516]。基于上述原因，本研究选用兔建立肩袖损伤模型，研究医用几丁糖在兔肩袖肌腱修复术后对腱骨愈合和肌腱及周围组织粘连的影响。

几丁糖具有生物相容性、生物可降解性、无毒性和吸附性等特点[17]，是一种良好的促进腱骨愈合和防止肌腱粘连的生物材料。几丁糖预防关节再粘连的可能机制如下。①润滑作用和生物屏障作用：几丁糖在理化性质上与关节内氨基多糖相似，具有黏弹性，另外几丁糖具有良好的成膜性，置于术后有可能发生粘连的组织之间起到“短期屏障”作用，从而达到预防关节粘连的目的[18]；②促进组织修复，抑制成纤维细胞的增生，减少胶原纤维分泌合成，从而预防冈上肌腱粘连的发生[1920]；③止血作用：减少创面出血可预防粘连形成[2]；④抗菌作用：幾丁糖能抑制受创组织自身炎症的发生，使冈上肌腱内源性愈合，预防肌腱粘连的发生[21]。目前，临床上应用的几丁糖制剂形式主要包括医用几丁糖液体辅料和几丁糖凝胶，由于液体辅料比凝胶形式具有更良好的物理扩散性及生物可降解性，因此本研究直接采用医用几丁糖液体敷料作为实验用药，探讨其对兔肩袖损伤模型修复术后腱骨愈合和肌腱及周围组织粘连的影响。

有研究结果显示，术后2周几丁糖组肌腱几乎未见明显的愈合，术后早期（4周内），由于几丁糖薄膜的隔离作用影响了外源性愈合，几丁糖对愈合有明显的抑制作用；术后4周时肌腱开始愈合，几丁糖组肌腱周围毛细血管数量增加，这与几丁糖刺激血管内皮细胞生长有关，有利于以后的肌腱愈合[22]。肌腱及周围组织粘连大多发生在修复的早期（术后5～7 d为粘连的高发期），几丁糖在体内1～2周开始降解，4周降解完毕，因此几丁糖的半衰期与腱骨愈合期和粘连高峰期相吻合。有研究将软骨细胞接种于几丁糖凝胶中，可见软骨细胞在几丁糖中维持圆形，增殖、分化活跃，表明几丁糖能够稳定地维持软骨细胞的表型表达[24]。有研究显示，软骨细胞不仅在几丁糖膜上生长良好，而且还分泌胶原Ⅱ[25]。这些研究结果表明几丁糖适合作为软骨组织工程研究的细胞载体材料。另外，几丁糖和软骨基质糖氨多糖结构相似，具有良好的生物相容性和可降解性，对软骨细胞有较好的吸附作用，可促进软骨细胞的增殖与分化，具有促进软骨修复的能力[2627]，表明几丁糖是一种良好的修复和重建软骨载体。本实验结果显示，A组在腱骨愈合处软骨细胞的分化增殖较B组明显活跃，提示几丁糖可促进软骨细胞的增殖，而软骨细胞增殖可以增强腱骨界面组织的软骨再生能力，从而促进兔肩袖肌腱的生物修复。另外，A组在肌腱处的成纤维细胞排列紧密，沿受力方向排列，与正常肌腱细胞方向大致相同，这有利于肌腱的结构重塑和构建。肩袖修补术后，肩袖肌肉常存在不同程度的脂肪浸润，可导致组织弹性的下降，影响肩关节功能的恢复[28]。有研究显示，几丁糖具有降血脂的作用，其机制可能是由于它具有抑制脂肪吸收的作用[29]，例如用高脂膳食喂养家兔建立动脉粥样硬化模型，几丁糖可以减轻肝脏脂肪样变[30]。本研究结果显示，A组肌腱组织中无明显脂肪浸润，而B组有明显脂肪浸润并可见少量脂肪空泡。据此我们推测，几丁糖具有减轻肌腱组织脂肪样变的作用，此方面的研究国内外尚未见报道，需今后增加动物模型的数量做进一步的探讨。

RODEN等[30]的研究结果显示，当骨长入由骨隧道的边缘和肌腱形成的纤维血管界面组织时，腱骨愈合就开始了。在重建后至少8周内愈合的韧带应该得到保护。LIU等[31]在术后6周内观察到间接腱骨插入，因此至少在兔模型中腱骨重要的愈合时期应确定在术后的前6周内。张辉等[22]通过切断来亨鸡的趾深屈肌腱、在其周围包裹几丁糖薄膜来观察肌腱的愈合情况，结果显示几丁糖薄膜在早期（即4周内）可以影响肌腱愈合，4周后可加快肌腱愈合和增加肌腱抗张强度。有研究探讨了几丁糖促进肌腱愈合的机制：①具有促进组织（上皮细胞）生理性愈合的作用；②具有屏障作用；③具有抗菌作用；④具有防粘连作用[32]。综合本实验结果，我们认为几丁糖在兔肩袖肌腱修复术后的腱骨修复过程中起到积极促进作用。

肌腱及周围组织粘连发生的机制是由于参与肌腱愈合的肌腱细胞和腱周组织来源的外源细胞（成纤维细胞为主）生长连接成整体的组织。肌腱在外源性愈合过程中，成纤维细胞从外周向损伤中心生长，同时分泌合成大量的胶原纤维，参与肌腱的愈合，是形成肌腱及周围组织粘连的原因。内源性愈合通过肌腱本身细胞增生、分化、分泌胶原纤维来完成肌腱的修复，不对肌腱及周围组织粘连产生影响[2]。因此，肌腱的粘连程度取决于这两种愈合机制在肌腱愈合过程中所占的比例大小。腱骨修复与成纤维细胞的数量有关，成纤维细胞数量增多在一定程度上促进了肌腱的外源性愈合，而减少了内源性愈合，因此不利于兔肩袖腱骨的生物修复。有研究结果表明，几丁糖能抑制腱周围成纤维细胞增生，预防肌腱粘连，但不影响肌腱愈合质量[21]。几丁糖可抑制成纤维细胞增生，促进腱骨愈合，腱鞘光滑且间隙较宽，无明顯粘连。肉芽组织在组织损伤后1～2周逐渐成熟，此时成纤维细胞产生越来越多的胶原纤维从而转变为纤维细胞，肉芽组织转化为纤维结缔组织进一步转变为瘢痕组织。本研究的大体解剖观察结果显示，A组肩袖表面瘢痕组织和肉芽组织明显少于B组，表明几丁糖可使肉芽组织生成减少，从而减少了纤维瘢痕组织的形成。本研究的组织学检查结果与大体解剖观察相吻合，即与B组比较，A组肌腱处成纤维母细胞及成纤维细胞数量明显减少，提示几丁糖可以抑制成纤维细胞的生长，抑制外源性愈合，从而达到预防肌腱及周围组织粘连的目的。根据实验结果我们推断：成纤维细胞是粘连和瘢痕组织的效应细胞，是粘连形成的决定性因素之一；几丁糖能够抑制成纤维细胞增生，减少胶原纤维和瘢痕组织形成的机会，从而预防肌腱及周围组织粘连。上述研究结果也为我们大体解剖观察到的A组肩袖肌腱及周围组织粘连等级显著低于B组提供了理论依据。有研究初步阐明了几丁糖抑制成纤维细胞增生和胶原生成分子机制，即在术后肌腱愈合过程中几丁糖是通过上调miR29介导下调TGFβ1/Smad3，从而抑制成纤维细胞增殖。

需要指出的是，本研究存在如下局限性。最主要的是实验动物的样本量较小，而大样本的动物实验才能得出更准确的结论。其次，根据文献报道，肩袖修补术后6周各种变化最明显，故本研究只选择术后6周观察结果，而选择术后不同时期进行观察所得结论可能更能说明问题。最后，尽管兔是建立肩袖损伤模型的合适动物，但它与人类并不完全相同。本研究以兔冈上肌肌腱（最常见的肌腱破裂）作为观察对象，然而最近研究表明兔的肩胛下肌可能更类似于人类的冈上肌[33]。今后我们将使用兔肩胛下肌作为观察对象，进一步探讨几丁糖在肩袖修补术后对腱骨愈合和肌腱及周围组织粘连的影响。

综上所述，几丁糖具有促进兔肩袖损伤修复术后腱骨愈合和预防肌腱及周围组织粘连的作用，这为临床上肩袖修补术后促进腱骨愈合和防止肌腱及周围组织粘连的发生提供了一种可行的方法。

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（本文编辑马伟平）