Ghrelin抑制A型钾通道电流对小鼠黑质多巴胺能神经元兴奋性的影响

薛宝　常晓丽　贾璐　石丽敏　谢俊霞

[摘要]目的

探讨ghrelin是否通过抑制A型钾通道电流增强正常小鼠黑质多巴胺能神经元的自发放电。

方法[HTSS]应用出生15～20 d的C57BL/6小鼠制备脑片，脑片全细胞膜片钳技术观察ghrelin对黑质多巴胺能神经元自发放电频率及A型钾通道电流幅度的影响。

结果[HTSS]小鼠黑质脑片灌流100 nmol/L ghrelin，多巴胺能神经元自发放电频率明显升高（n=5，t=3.55，P<0.05）；应用A型钾通道阻断剂4AP可以完全阻断ghrelin的细胞兴奋效应。应用100 nmol/L ghrelin可以明显抑制A型钾电流的电流幅度（n=5，t=5.67，P<0.01）。

结论[HTSS]Ghrelin能够提高正常小鼠黑质多巴胺能神经元的兴奋性，其机制可能是通过抑制A型钾通道电流实现的。

[关键词]胃促生长素；黑质；多巴胺能神经元；A型钾通道

[中图分类号]R338.8

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02012704

Ghrelin是1999年新發现的一种生物活性肽，是生长激素促分泌素受体（GHSR）的唯一内源性配体[12]，通过影响神经元的电活动，在摄食、能量代谢平衡、生长激素释放及学习记忆等多方面发挥重要调节作用。研究发现，ghrelin对帕金森病（PD）黑质多巴胺（DA）能神经元的损伤具有保护作用[34]，提示其在PD治疗中具有潜在应用前景。进一步研究结果显示，ghrelin可以促进黑质DA能神经元电活动[5]。由于黑质DA能神经元的电活动变化直接影响纹状体区DA的释放，在黑质纹状体系统的功能调节以及PD中发挥着重要的作用[6]，因此，阐明ghrelin调控黑质DA能神经元电活动的机制具有重要的意义。A型钾通道电流（IA）是一种快速激活、快速失活的钾电流[78]，在黑质DA能神经元上有较高表达，是影响DA能神经元自发放电的关键因素，对动作电位的幅度、时程和放电频率发挥着重要的调节作用[3，911]。以往有研究指出，ghrelin可以显著降低体外培养的GH3细胞系中IA的电流幅度[5，12]。

然而，ghrelin是否对黑质DA能神经元的IA有影响并由此改变神经元的兴奋性目前尚不清楚。本研究旨在探讨ghrelin对黑质DA能神经元中IA的影响及对神经元自身兴奋效应的调控作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物出生后15～20 d的C57BL/6小鼠，由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供。

1.1.2实验试剂Ghrelin为美国Tocris公司提供，开封前需在离心机上离心，然后用无菌注射器注入无菌水，稀释为10-4 mol/L，-20 ℃保存，用前稀释至10-7 mol/L。河鲀毒素（TTX）由美国Tocris公司提供，用人工脑脊液（ACSF）稀释成1.0 mmol/L的母液，终浓度为0.5 nmol/L。氯化镉 （CdCl2）、4氨基吡啶 （4AP） 为美国Sigma公司产品。

1.1.3溶液配制①ACSF的配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、1.3 mmol/L NaH2PO4、

26.0 mmol/L NaHCO3、1.3 mmol/L CaCl2、2.4 mmol/

L MgCl2、10.0 mmol/L Glucose混合，调整pH值7.4 （1 mol/L NaOH稀释），

渗透压770 kPa（用渗透

压测量仪测量），并持续通入含体积分数

0.05 CO2及体积分数0.95 O2的混合气进行氧合。②低钙切片液配制：124.0 mmol/L NaCl、3.0 mmol/L KCl、1.3 mmol/L NaH2PO4、26.0 mmol/L NaHCO3、2.0 mmol/L CaCl2、

1.0 mmol/L MgCl2、10.0 mmol/

L Glucose混合，使用1 mol/L的NaOH 调节溶液的pH值至7.4，渗透压为770 kPa（用渗透压测量仪检测），并持续通含体积分数为0.05的CO2及体积分数0.95的O2的混合气进行氧合。③电极内液的配制：120.0 mmol/L Kgluconate、20.0 mmol/L KCl、

10.0 mmol/L HEPES、10.0 mmol/L EGTA、2.0 mmol/L MgCl2、

2.0 mmol/L Na2ATP以及0.3 mmol/L的Na2GTP混合，

用1 mol/L KOH 调节 pH 值为7.3，500 μL分装后-20 ℃储存备用。

1.2实验方法

1.2.1离体黑质脑片制备小鼠迅速断头取脑，并置于4 ℃下ACSF中，1 min后将修剪好的脑切成250 μm厚的脑切片，放入连续通入体积分数0.95 O2及体积分数0.05 CO2混合气体的ACSF中，孵育1 h，然后将脑片室温下放置。随机取其中一片脑片进行脑片全细胞膜片钳实验，其余的脑片培养在 ACSF 中，用于后续实验。

1.2.2脑片全细胞膜片钳电生理学记录将离体脑片转移至持续灌流ACSF（持续通入有体积分数0.95 O2及体积分数0.05 CO2混合气体）的浴槽内，选择健康、饱满、边界清晰的细胞进行全细胞膜片钳记录。将抛光的玻璃微电极（电阻为5～10 MΩ）注入合适体积的电极内液，直至电极尖端进入液面以下，当电极尖端慢慢接近细胞表面直至在细胞表面压出类似“酒窝”的形状，此时电流变小，电阻慢慢变大。迅速释放正压，快速达到千兆封接（GΩ）。如果电阻没有达到千兆，则通过注射器给予细胞膜片一个负压，使之达到千兆封接，并补偿快电容。之后，采用负压法吸破电极与细胞相接触的膜片，使电极与细胞内液相通，并补偿慢电容。转换至电流钳模式，将电流钳置在0 pA，完成全细胞电流钳记录模式，判断为黑质DA能神经元后，转换至全细胞电压钳模式，将电压钳置在-70 mV，完成全细胞电压钳模式电流记录。数据用Patchmaster软件采样并储存，用Minianalysis、Clamfit等软件分析。

1.3统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，实验结果采用[AKx-D]±s表示。同一个神经元加不同药物自发放电频率比较采用方差分析；同一个神经元加药前后IA幅度变化比较采用配对t检验。以P<0.05表示差异有显著性。

2结果

2.1Ghrelin对黑质DA能神经元自发放电频率的影响

本文实验记录了5个黑质DA能神经元，自发放电频率为（1.84±0.24）Hz，灌流含有100 nmol/L ghrelin的ACSF后，神经元放电频率为（2.63±0.44）Hz，与加药前相比明显增加，差异有显著意义（t=3.55，P<0.05）。随后，为了验证ghrelin是否通过A型钾通道发挥调节作用的，加入A型钾通道特异性阻断剂4AP（1 mmol/L），结果显示，神经元放电频率增加到（2.71±0.98）Hz，与神经元最初的自发放电频率相比明显增加（F=13.21，P<0.01）。应用ACSF冲洗脑片，当细胞放电频率基本恢复正常以后，同时给予4AP和ghrelin，结果显示，神经元放电频率为（2.74±0.46）Hz，与单独应用4AP相比差异无显著性（P>0.05）。

2.2Ghrelin對黑质DA能神经元IA幅度的影响

在记录的5个神经元中，IA的平均电流幅度为（333.68±143.76）pA，应用含100 nmol/L ghrelin的ACSF灌流后，IA的电流幅度降低到（153.43±167.87）pA，二者比较差异有显著意义（t=5.67，P<0.01）。

3讨论

A型钾通道又称为瞬时外向型钾通道，是在黑

质DA能神经元上广泛存在的一种电压依赖型钾通道，具有较大的电流幅度[7，9，13]。在哺乳类动物中枢神经系统，A型钾通道由Kv4（KCND13）基因家族形成的α亚基以及KChip（KCNIP14）基因家族形成的辅助β亚基共同组成[1415]，其中Kv4.3/KChip3.1是黑质DA能神经元上A型钾通道主要的组成部分[1618]。以往研究证实，A型钾通道对动作电位的幅度、时程和放电频率发挥着重要的精细调节作用，阻断该通道可明显提高DA能神经元的放电频率[16，1924]。

为了探讨ghrelin的细胞兴奋效应是否通过抑制IA而实现，本实验在C57BL/6小鼠脑片的黑质DA能神经元上，首先应用IA的特异性抑制剂4AP，结果显示黑质DA能神经元兴奋性显著增加；之后再加入4AP与ghrelin混合液，结果显示与单独应用4AP的作用差异无显著性，说明由于A型钾通道受到抑制，ghrelin对DA能神经元的作用被抑制，提示ghrelin对神经元兴奋性的影响可能是通过抑制A型钾通道来实现的。本文实验进一步用加入钙离子阻断剂CdCl2和钠离子阻断剂TTX的ACSF灌流脑片，之后给予100 nmol/L的ghrelin，观察到IA的电流幅度明显降低，从而验证了ghrelin对A型钾通道具有抑制作用。

DA能神经元是黑质致密带上存在的一种可兴奋性神经元，在离体脑片记录中，DA能神经元在静息状态下有规律的自发放电，放电频率普遍在1～10 Hz之间[25]。DA能神经元的兴奋性主要由细胞静息膜电位水平和跨膜离子电流的特性决定，有多种离子参与其中，比如钾离子、钠离子和钙离子等，其中电压依赖型钾离子通道在维持DA能神经元自发放电等过程中发挥至关重要的作用，其中尤以A型钾通道最为重要[2627]。ghrelin通过提高神经元的兴奋性，使其释放到纹状体内的DA含量增加，从而对黑质纹状体系统产生重要的调节作用[1，2729]。本实验室的前期研究显示，ghrelin对PD具有神经保护效应[1]。结合本文结果，认为ghrelin可能通过神经保护和电活动调控两方面共同改善黑质纹状体系统功能。即ghrelin通过抑制黑质DA能神经元上的IA，从而提高神经元自发放电频率，增强神经元的兴奋性。本文研究结果为ghrelin在PD中的应用提供了新的实验依据，ghrelin在PD的治疗中将具有极大的应用前景。

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