水稻化感品种根区土壤微生物群落反馈对伴生稗草的影响

孙　备，沈　樱，张　雪，苏本卿，王国骄 ，郭　伟，周　斌

(1.沈阳农业大学 农学院，辽宁 沈阳 110866； 2.辽宁省水稻研究所，辽宁 沈阳 110101；3.辽宁省气象科学研究所，辽宁 沈阳 110166)

竞争和化感是影响植物种间相互作用的重要途径。无论是资源竞争，还是化感物质干扰，土壤生态系统都是重要的媒介之一。事实上，植物能够影响土壤生物和非生物的性质，反过来影响植物本身和其他植物的生长，这种现象称之为植物-土壤反馈[1]。植物-土壤反馈在植物种间关系、群落组成和演替以及生态系统功能等方面起重要作用[2-3]。在土壤生态系统众多生态因子中，土壤养分和微生物与植物生长关系最为密切，二者是调节植物-土壤反馈的重要因素[4-5]。植物化感特性不同的生态型，对土壤生态系统特别是土壤生物的影响存在差异，这种差异将导致产生不同的植物-土壤反馈过程[6-7]。因此，研究化感特性不同的生态型调节的土壤反馈对共存物种生长的影响，将有助于更好地揭示化感作用在植物种间关系中的意义。

水稻和稗草在稻田生态系统中长期共存。稗草能够影响水稻生长，导致水稻产量下降，但不同水稻品种对稗草生长发育的影响也存在差异，特别是水稻化感品种可以显著抑制稗草的生长[8-10]。水稻化感品种和非化感品种属于不同的生态型。水稻化感品种能够通过根分泌环己烯酮、二萜内酯和黄酮甙元等化感物质，直接抑制稗草的生长，提高自身对稗草的竞争力[11-12]。植物根分泌物是土壤有机物质的主要来源之一[13]，能够影响土壤微生物活动和土壤养分状况，是调节植物-土壤反馈的重要因素[3,14]。水稻化感品种根分泌物不仅可以直接抑制稗草的生长，还能够影响稻田土壤酶活性和土壤微生物群落[15-17]，但水稻化感品种和非化感品种土壤微生物群落的差异对水稻和稗草种间相互作用的影响尚不清楚。为此，研究水稻化感品种土壤微生物群落反馈对伴生稗草的影响，探讨土壤微生物群落反馈对水稻和稗草种间相互作用的影响，以期揭示植物-土壤反馈在化感特性不同水稻品种与稗草种间关系中的作用。

1　材料和方法

1.1　试验材料及试验地概况

水稻化感品种选择PI321777，来源于美国USDA-ARS种质资源库，是国内外公认的水稻化感品种。水稻非化感品种选择辽粳9，通过特征次生物质标记和田间试验方法评价确定为非化感品种，由辽宁水稻研究所提供。稗草(Echinochloacrusgalli)种子收集于中国科学院沈阳生态实验站，自然风干后在尼龙袋中保存。

试验地位于中国科学院沈阳生态试验站(41°31′N、123°24′E)，土壤类型为淋溶土(斑纹简育湿润淋溶土)。土壤基本理化性质为pH值 6.54 ± 0.38、有机质含量17.4 g/kg、全氮含量1.6 g/kg、速效氮含量178.14 mg/kg、全磷含量0.41 g/kg、速效磷含量70.04 mg/kg、全钾含量1.20 g/kg、速效钾含量 53.80 mg/kg。

1.2　样品采集

1.2.1土壤样品采集水田0～15 cm的表层土壤，过0.5 mm筛，备用。

1.2.2土壤接种物将预萌发的水稻和稗草种子直播于8 cm×12 cm的盆中，每盆装入800 g土壤，每盆8穴，每穴2株。水稻生长至5叶期，取化感品种PI312777、非化感品种辽粳9和稗草根区土壤作为土壤接种物，并取样测定土壤磷脂脂肪酸(PLFA)含量。

1.2.3根分泌物采用水培试验收集水稻和稗草的根分泌物[12]。将水稻和稗草培养至4叶期，每种植物选择根长和苗高相对一致的100株幼苗用于根分泌物的收集。将幼苗基部用海绵包裹后，插入泡沫板，放入盛有1/2 Hoagland培养液的水培容器(20 cm×12 cm×5 cm)中。将水培容器置于28 ℃、12 h光照的生长箱中培养，每24 h补充一次蒸馏水。5 d后将水培液用灭菌滤纸过滤，获得化感品种PI312777、非化感品种辽粳9和稗草的根分泌物。

1.3　土壤PLFA含量测定

取5 g过筛冻干土壤，依次加入磷酸缓冲液、氯仿、甲醇(体积分别为4、5、10 mL)，提取 2 h，振荡、离心后，提取CHCl3层，用氮气吹干，过硅胶柱(美国Supelco生产)，依次采用氯仿5 mL、丙酮10 mL、甲醇5 mL洗脱，收集甲醇相，吹干。再用氢氧化钾-甲醇溶液进行皂化，最后用正己烷萃取，收集正己烷相，分离得到的脂肪酸甲酯用气相色谱质谱仪(GC-MS)测定。以正十九烷脂肪酸甲酯为内标，各脂肪酸的识别与定量以细菌脂肪酸甲酯混标和37种脂肪酸甲酯混标确定。用11种脂肪酸 (i15∶0、a15∶0、15∶0、16∶0、i16∶0、16∶ω7c、i17∶0、17∶0、cy17∶0、cy19∶0、18∶3ω6) 表征细菌生物量。其中，i15∶0、a15∶0、i16∶0和i17∶0表征革兰氏阳性细菌，16:1ω7c、cy17∶0、2-OH16∶0和cy19∶0 表征革兰氏阴性细菌。真菌生物量通过18∶2ω6,9c、18∶ω9c和18∶ω9t计算，用10Me17∶0估算放线菌生物量[15]。

1.4　试验设计

1.4.1不同来源土壤接种物和根分泌物对稗草生物量的影响将化感品种PI312777、非化感品种辽粳9和稗草的土壤接种物分别与灭菌土壤按1∶9的比例混合，然后装入8 cm×12 cm的盆中，每盆装800 g土壤，用来进行土壤接种物对稗草生物量的影响研究。在上述添加土壤接种物的基础上，再分别对应加入600 mL化感品种PI312777、非化感品种辽粳9和稗草的根分泌物，混合均匀，用来进行根分泌物对稗草生物量的影响研究。将稗草预萌发的种子播种于处理好的土壤中，每盆播种8穴，每穴1株，每个处理5个重复。植物出苗后35 d取样，测定生物量。

1.4.2不同来源土壤接种物对混种水稻和稗草生物量的影响设置水稻、稗草单种以及水稻和稗草混种2种种植处理，将预萌发的水稻和稗草种子播种于含有不同土壤接种物的土壤中。每个处理5个重复。混种处理中，水稻和稗草按1∶混合种植。每盆播种8穴，每穴1株。水稻生长至5叶期时，分别收获水稻和稗草，将地上和地下部分清洗干净后，测定生物量。

1.5　数据处理

采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较不同处理对水稻和稗草生物量的影响，采用Tukey’s检验比较不同处理间的差异。数据采用SPSS 16.0进行统计分析，图表采用Excel 2007制作。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较不同来源土壤特征脂肪酸含量。土壤特征脂肪酸相对丰度的主成分分析(PCA)采用Statistica 6.0进行，并对特征脂肪酸相对丰度值进行对数转化以满足主成分分析数据正态分布的需要。通过对土壤接种物PLFA主成分得分进行多元方差分析(MANOVA)比较不同来源土壤微生物群落结构的差异。主成分分析图用SigmaPlot 12.0绘制。

2　结果与分析

2.1　不同来源土壤微生物群落结构差异

采用15种相对含量比较高的脂肪酸来表征不同水稻品种和稗草根区土壤微生物群落结构(表1)。由表1可知，水稻化感品种PI312777根区土壤总PLFA含量最低，稗草根区土壤总PLFA含量最高，稗草根区土壤总PLFA含量、细菌PLFA含量、真菌PLFA含量和放线菌PLFA含量均显著高于PI31277根区土壤，但与非化感品种辽粳9根区土壤差异不显著(放线菌PLFA含量除外)。不同来源的土壤真菌和细菌PLFA含量比值无显著差异；不同来源的土壤革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌PLFA含量的比值不同，稗草根区土壤革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌PLFA含量的比值极显著高于水稻根区土壤，2个水稻品种之间差异不显著。

对水稻化感品种、非化感品种和稗草根区土壤微生物PLFA主成分分析(图1)表明，第一主成分PCA1解释了55.01%的变异，第二主成分PCA2解释了16.87%的变异，二者累计解释了71.88%的变异。15种脂肪酸与2个主成分的相关系数表明，饱和脂肪酸是影响土壤微生物群落的主要因素。第一主成分PCA1与饱和脂肪酸15:0、16:0呈显著正相关，与饱和脂肪酸17:0呈显著负相关。第二主成分PCA2与饱和脂肪酸14:0、i16:0、i17:0相关系数r>0.5。水稻化感品种、非化感品种和稗草根区土壤PLFA在主成分分析中各占不同的空间，化感品种PI312777根区土壤PLFA位于图的右侧，非化感品种辽粳9根区土壤PLFA位于图的上方，而稗草根区土壤PLFA位于图的左下方(图1)。多元方差分析表明，水稻化感品种、非化感品种和稗草根区土壤微生物PLFA组成存在极显著差异(P<0.001)，三者土壤微生物群落结构有所不同。

表1不同水稻品种和稗草根区土壤PLFA含量nmol/g

指标PI312777辽粳9稗草细菌2.80±0.46bA3.39±1.06abA6.49±l.15aA真菌1.18±0.14bB1.50±0.33abAB2.74±1.20aA放线菌0.10±0.02bB0.11±0.02bB0.23±0.07aA真菌/细菌0.43±0.04aA0.45±0.06aA0.43±0.05aAG (+)/G (-)0.65±0.11bB0.75±0.07bB1.11±0.06aA总PLFA4.23±0.62bB5.15±1.40abAB9.73±4.43aA

注：同行数据后不同大、小写字母表示不同处理之间差异极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)。

交叉线表示原点(0,0)

2.2　不同来源接种物对稗草生物量的影响

不同来源的土壤接种物对稗草生物量的影响不同(图2)。PI312777根区土壤接种物处理稗草生物量高于稗草自身根区土壤接种物处理和辽粳9根区土壤接种物处理，但与辽粳9根区土壤接种物处理差异未达到显著水平。添加根分泌物的PI312777根区土壤接种物处理稗草生物量仍显著高于添加稗草自身根分泌物的土壤接种物处理，但显著低于添加根分泌物的辽粳9根区土壤接种物处理，表明添加根分泌物的化感水稻土壤接种物对稗草生长的促进作用低于非化感水稻土壤接种物，添加根分泌物影响了不同土壤接种物对稗草生长的反馈作用。

不同小写字母表示不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同

2.3　混种条件下不同来源土壤接种物对水稻和稗草生物量的影响

2.3.1稗草由图3可知，尽管单种条件下，PI312777根区土壤接种物处理稗草生物量显著高于稗草土壤接种物处理，但混种条件下PI312777根区土壤接种物处理稗草生物量显著低于稗草根区土壤接种物处理。无论是单种还是混种条件下，辽粳9根区土壤接种物处理稗草生物量均高于稗草根区土壤接种物处理。不同来源土壤接种物处理条件下，与不同水稻品种混种对稗草生物量的影响也不同。与PI312777混种条件下，稗草根区土壤接种物处理稗草生物量与单种相比降低40.67%，PI312777根区土壤接种物处理与单种相比降低70.29%。与辽粳9混种条件下，稗草根区土壤接种物处理稗草生物量较单种降低18.09%，辽粳9根区土壤接种物处理较单种提高12.92%，且显著高于稗草根区土壤接种物处理。可见，混种条件下，辽粳9根区土壤接种物更有利于稗草的生长。

2.3.2水稻由图4可知，无论是稗草根区土壤接种物处理还是PI312777根区土壤接种物处理，混种条件下PI312777生物量均显著高于单种。但单种和混种条件下，PI312777根区土壤接种物处理PI312777生物量与稗草根区土壤接种物处理差异均未达到显著水平。单种条件下，稗草根区土壤接种物处理辽粳9生物量与辽粳9根区土壤接种物处理差异不显著；混种条件下，稗草根区土壤接种物处理辽粳9生物量较辽粳9自身根区土壤接种物处理显著降低。对于稗草根区土壤接种物处理，混种条件下辽粳9生物量与单种差异不显著；对于辽粳9根区土壤接种物处理，辽粳9混种生物量较单种显著提高22.49%。

图3　水稻和稗草根区土壤接种物对稗草生物量的影响

图4　水稻和稗草根区土壤接种物对水稻生物量的影响

3　结论与讨论

植物-土壤反馈是植物种间相互作用的重要机制。水稻化感品种和非化感品种调节的土壤反馈对稗草生长发育的影响不同，水稻化感品种根区土壤导致稗草生物量下降，调节不利于稗草生长的负反馈，而非化感品种对稗草生长无反馈影响[18]。调节土壤负反馈的机制包括资源的消耗、有害微生物的积累和化感作用[3,5]。现有研究表明，土壤养分在水稻化感品种调节的不利于稗草生长的负反馈中的作用是有限的，土壤微生物在水稻化感品种与稗草种间相互关系中起重要作用[18]。本研究结果也表明，水稻化感品种、非化感品种和稗草根区土壤微生物群落结构存在明显差异，土壤真菌、细菌、放线菌以及总的PLFA含量明显不同。但稗草单种条件下，水稻化感品种根区土壤接种物促进了稗草的生长，这与化感水稻根区土壤对稗草生长有负反馈影响的结果[18]相反。

土壤微生物多是依靠外源有机碳提供营养和能量维持生长的异养生物。根分泌物是土壤有机碳的重要来源之一，植物根分泌物的差异能够影响土壤微生物群落的组成和结构[13]。水稻化感品种和非化感品种根分泌物的差异是影响二者根区土壤微生物群落差异的重要因素[17]。本研究中，化感水稻品种根区土壤接种物处理稗草生物量高于非化感水稻品种根区土壤接种物处理，但添加根分泌物的化感水稻品种根区土壤接种物处理稗草生物量显著低于非化感水稻品种根区土壤接种物处理，表明化感水稻根分泌物能够影响土壤微生物群落调节的反馈作用。水稻化感品种根分泌物对土壤PLFA组成的影响与其化感物质对土壤PLFA组成的影响具有显著的相关性[16]，水稻化感品种根分泌物对土壤微生物反馈的影响可能是化感物质对微生物群落调节的结果。但化感物质的半衰期相对比较短，不超过30 h[19]，在没有水稻根分泌物持续输入的条件下，不同水稻品种根分泌物对土壤微生物群落影响的差异会随着时间的延长、化感物质的降解而逐渐减小[15-16]。本研究采用近年来常用的土壤接种的方法研究土壤微生物群落的反馈作用，将不同来源的土壤接种物与灭菌土壤按1∶9的比例混合，从而有效地消除土壤养分差异对土壤微生物群落反馈的影响，但会增加反馈阶段栽培植物对土壤微生物群落的调节作用[20]。本研究中，较少的土壤接种物的加入会减弱水稻化感品种根分泌物对土壤微生物群落的调节作用，土壤接种物处理微生物群落组成和结构可能会受反馈阶段种植的稗草根分泌物的影响。化感水稻根分泌物的添加能够在生长前期影响化感水稻土壤接种物处理的土壤微生物群落，从而减弱反馈阶段稗草对土壤微生物群落的影响，导致添加根分泌物的化感水稻土壤接种物处理稗草生物量显著低于非化感水稻处理，与非化感水稻品种相比，调节了不利于稗草生长的负反馈。

在2个物种共存的系统中，共存植物对土壤生态系统产生影响，可能改变土壤反馈的强度和方向[21-23]。对于2个共存的物种，植物-土壤反馈在单种和混种条件下反馈的方向和强度可能不同，混种条件下土壤反馈的研究更有助于揭示植物-土壤反馈对植物生长及种间相互作用的影响[24-25]。本研究中，混种条件下，稗草根区土壤接种物处理稗草生物量显著高于化感水稻品种根区土壤接种物处理，显著低于非化感水稻根区土壤接种物处理，表明混种条件下，化感水稻根区土壤微生物群落调节了不利于稗草生长的负反馈，非化感水稻根区土壤微生物调节了有利于稗草生长的正反馈，与单种条件下土壤微生物的反馈影响不同。这可能是由于在水稻和稗草共存的混种系统中，伴生水稻的存在能够向土壤中持续输入根分泌物，化感水稻根分泌物对土壤微生物的调控和影响加强，改变了单种条件下不同来源土壤接种物对稗草的反馈影响。

不同物种调节的土壤反馈的差异同样能够影响共存物种的竞争，土壤反馈对种间竞争的影响因物种而异，土壤反馈能够增强或减弱物种的竞争力，也可能对竞争无影响[26-28]。本研究中，混种条件与单种条件相比，化感水稻土壤接种处理稗草生物量的降低显著高于稗草自身土壤接种处理，化感水稻土壤接种物提高了水稻化感品种对稗草的竞争力。与非化感水稻混种，稗草根区土壤接种物处理稗草生物量低于单种，非化感水稻根区土壤接种物处理稗草生物量高于单种，表明混种条件下，非化感水稻根区土壤接种物降低了自身对稗草的竞争力。不仅水稻化感品种和非化感品种调节的土壤微生物反馈对稗草的影响不同，二者对稗草根区土壤微生物反馈的响应也存在差异。无论是单种还是混种条件下，稗草根区土壤接种物和化感水稻根区土壤接种物处理对水稻化感品种生物量的影响差异均不显著，稗草根区土壤微生物对水稻化感品种无反馈影响。但非化感水稻品种自身根区土壤接种物处理混种水稻生物量高于单种处理，而稗草根区土壤接种物处理混种水稻生物量与单种处理差异不显著，表明稗草根区土壤接种物降低了非化感水稻对稗草的竞争能力。土壤反馈和竞争相互作用表明，水稻化感品种根区土壤微生物群落调节了不利于稗草生长的负反馈，提高了自身对稗草的竞争力；非化感水稻品种根区土壤微生物群落调节了有利于稗草生长的正反馈，而稗草根区土壤微生物群落调节了不利于非化感水稻的负反馈，提高了稗草对非化感水稻的竞争力。化感特性不同的水稻品种对水稻和稗草共存系统中微生物调节的植物-土壤反馈的影响和响应的差异能够影响水稻和稗草的种间相互作用，水稻化感品种调节的植物-土壤反馈增强了其对稗草的抑制作用。

致谢：感谢中国科学院沈阳生态实验站在试验过程中提供的帮助。