AOPE基因定点突变质粒的构建及qPCR鉴定

覃鸿妮　谢钰珍　杜雅馨

摘要：随机选取5份待检测老年痴呆症的唾液标本，等量混合后提取基因组DNA并通过PCR扩增人第19号染色体上的载脂蛋白E（AOPE）基因，再与PMD19T质粒连接构建重组质粒，转入DH5α感受态细胞中。经菌液PCR和测序鉴定为阳性的克隆抽取其质粒，以此重组质粒为模板通过PCR对AOPE基因的rs7421位点G突变为T，构建的突变质粒经qPCR鉴定，得到相应的荧光值，不同基因型的结果分成三类聚类图：CC型（野生纯合），CR型（杂合突变）和RR型（纯合突变），将得到的荧光数据值上传到生物信息数据库当中，以此为依据可以从AOPE基因层面上对待检测对象的阿尔茨海默病发病风险做出评估。

关键词：AOPE基因；定点突变；重组质粒；qPCR鉴定

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又称老年痴呆，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。[1]临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。[2]近十年内，大量研究显示，对AD的防治虽已展现出良好的发展前景，并研发出许多有效药物。但中国的情况不容乐观，中国有将近1000多万的AD患者，未来这一数字还将不断增加。也正因為AD问题的严峻性，早期干预，早发现，早治疗对于延缓AD病情发展甚至治愈具有极大的重要性[2，3]。

影响患者患阿尔茨海默病风险的危险因素有很多，年龄占主要位置，患阿尔茨海默病的危险随着患者年龄的每增加五岁而增加一倍，且低受教育程度可明显增加该病患病风险。[4]基因突变居于其后，第14号染色体上的早老素Ⅰ基因、第1号染色体上的早老素Ⅱ基因、第21号染色体上的淀粉样前体蛋白基因以及第19号染色体上的载脂蛋白E基因，是目前能够确定的突变基因，与遗传性阿尔茨海默病有关的突变基因为前三者，与发散性阿尔茨海默病有关的则为aopE4基因，是最强遗传性危险因素[5，6]。

AOPE基因是人第19号染色体上的载脂蛋白E基因，该基因突变使得阿尔茨海默病患病率风险增加的高危险因子为AOPE4，它存在于老年斑和神经纤维缠结中[7，8]。通过qPCR实验扩增基因信息后得到相关数据，然后运用生物信息技术分析各种基因情况。倘若检测的基因中含有AOPE4，则该检测者可能存在阿尔茨海默病的患病风险，但不一定得阿尔茨海默病，然后进行个性化指导用药。让检测者做到早发现、早预防，最大限度的做到缓解或阻止疾病的发生。[9]本研究随机选取5份待检测老年痴呆症的唾液标本，等量混合后提取基因组DNA并通过PCR扩增AOPE基因，构建重组质粒并通过定点突变构建突变质粒，运用qPCR平台作为阳性质控，将得到的荧光数据值上传到生物信息数据库当中，以此为依据从AOPE基因层面上对待检测对象的阿尔茨海默病发病风险做出评估。

1 材料与方法

1.1 试验材料

随机选取5份待检测老年痴呆症的唾液标本（健路生物科技（苏州）有限公司），各取500ul混合作为基因组DNA提取的材料。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的获取及定量

利用天隆NP968型核酸提取仪提取唾液基因组DNA，配套深孔板试剂加入如表3，将深孔板按照字母A处于左上方的方向及磁棒套放入仪器内，选中程序操作。运行1 h后下机，将深孔板置于磁力架上，避免在转移基因组时吸到磁珠。

将基因组DNA转移到1.5 mL离心管中，为基因组DNA定量做准备。采用荧光定量法，使用荧光酶标仪，荧光染料可以与DNA双链特异结合，在485/540 nm波段发出荧光，最后通过标准曲线计算出样品的浓度。

1.2.2 目的基因的PCR及PCR产物的纯化

目的基因由金唯智生物科技有限公司设计和合成，提取的唾液基因组DNA作为PCR的模板，PCR产物吸取4ul进行琼脂糖凝胶电泳，目的DNA片段用胶回收试剂盒进行回收。

1.2.3 重组子构建及转化

将PCR产物与pMD19T载体在16℃下反应30min连接，连接产物采用CaCl2法转入DH5α感受态细胞，转化结束后混匀菌液并涂于已经加入Amp（100 ug / mL）的LB固体培养基中，倒置放入37 ℃培养箱中过夜，12 ～ 16小时后取出，观察菌落生长状况，无任何问题后将其放在4 ℃中保存2周。

1.2.4 转化子阳性鉴定

挑取3个单克隆，各加入含Amp（100 ug / mL）的LB液体培养基30ul，震荡斡旋5min，菌液作为菌液PCR的模板，PCR产物先用琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆菌选用载体上的M13F（47）进行基因测序。

1.2.5 目的基因的定点突变

将测序结果争取的克隆，采用质粒抽提试剂盒抽提相应菌液中的质粒。用Primer3设计突变引物，引物序列如表4。以质粒为PCR模板，加入突变引物构建点突变质粒，并用琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物中含有原始模板质粒，为了防止其在转化后形成假阳性转化子，须在进行重组环化之前进行Dpnl消化。消化产物在Exnase II催化下扩增产物5末端和3末端可以发生同源重组，完成扩增产物重组环化过程。重组子按照13.3的方法转入DH5α感受态细胞，最后挑取阳性克隆进行测序验证。将测序结果正确的菌液，进行质粒抽提，得到突变后质粒。根据位点的基因频率将构建的突变前、突变后质粒对应野生质粒命名为CC（基因型GG），纯合突变质粒为RR（基因型TT），杂合质粒为CR（基因型GT）。

1.2.6 荧光PCR检测

取1.5 mL离心管，按表5的体系配制10 uL检测体系，装入八连排PCR管中，转移到通风橱，向分装荧光反应液的孔中分别加入5 uL排PCR扩增产物、CC质粒扩增产物、RR质粒扩增产物、CR质粒扩增产物，盖紧反应管，转移至PCR扩增区，用荧光PCR仪，进行荧光PCR扩增。

将PCR产物切胶回收后，连接pMD19T，并进行转化，挑取单克隆，PCR进行菌检，通过凝胶电泳检测目的条带（图3 A），表明挑取的3个单克隆，均能通过PCR检测出目的条带，且大小为472bp；将有目的条带对应的菌液进行测序，其引物选用载体上M13F（47）通用引物（图3 B），其位点为单一峰，第292位氨基酸密码子碱基为G，没有发生突变与目的序列比对一致。

2.4 突变后质粒菌检及测序

采用点突变试剂盒对质粒进行突变后，再进行转化，挑取单克隆，PCR进行菌检，通过凝胶电泳检测目的条带（图4 A），表明挑取的3个单克隆，均能通过PCR检测出目的条带，其大小为490bp；将有目的条带对应的菌液由苏州金唯智测序公司进行测序，其引物选用载体上M13F（47）通用引物，得到反向测序结果（图4 B），其位点为单一峰，第294位氨基酸密码子碱基由G突变为A，即反向序列呈现出的突变位点碱基T，即发生突变与目的序列比对一致。

2.5 qPCR验证重组质粒

將构建成功的重组CC质粒（野生纯合）和RR质粒（纯合突变）稀释成5 ng/uL，再稀释成102，进一步再稀释成104；将102的CC质粒和RR质粒，1：1混合在一起，再稀释成104，作为工作质粒。通过荧光qPCR实验，得到相对的荧光值，根据软件读取到的荧光值，结果分成三类聚类图：CC型（野生纯合），CR型（杂合突变）和RR型（纯合突变）（图5）。将得到的荧光数据值上传到生物信息数据库当中，可以从AOPE基因层面上对阿尔茨海默病发病风险做出评估。图5中的DNA样品为实验室待检测阿尔茨海默病的标本，可见7例样本，仅有1例基因型为CR型，其他全部为CC型。

3 结论与讨论

以5份待检测老年痴呆症的唾液标本为材料，提取基因组DNA并通过PCR扩增人第19号染色体上的载脂蛋白E（AOPE）基因，再与PMD19T质粒连接构建重组质粒，转入DH5α感受态细胞中。经菌液PCR和测序鉴定为阳性的克隆抽取其质粒，以此重组质粒为模板通过PCR对AOPE基因的rs7421位点G突变为T，构建的突变质粒经qPCR鉴定，得到相应的荧光值，不同基因型的结果分成三类聚类图：CC型（野生纯合），CR型（杂合突变）和RR型（纯合突变），将得到的荧光数据值上传到生物信息数据库当中，以此为依据从AOPE基因层面上对待检测对象的阿尔茨海默病发病风险做出评估。

阿尔茨海默病是一种无法通过单个或多个基因筛查来进行早期诊断的多基因疾病。通过基因组方面的研究将阿尔茨海默病的研究发展推向了新的高峰，以阿尔茨海默病本身的是否存在、症状、严重程度作为表现型，用信号传导和基因功能的方法将其进行说明，对阿尔茨海默病的发病机制有了很大的帮助，在基因检测和遗传咨询方面也同时奠定了基础，同时对阿尔茨海默病的预防提供更多的有效性建议。[10]

参考文献：

[1]张静爽，王蓉.阿尔茨海默病发生机制的研究进展[J].首都医科大学学报，2014，（6）：721724.DOI：10.3969/j.issn.10067795.2014.06.009.

[2]洪震.我国阿尔茨海默病的研究现状及展望[J].中华神经科杂志，2001，34（4）：193195.DOI：10.3760/j.issn：10067876.2001.04.001.

[3]罗涛，段晨.阿尔茨海默病的国内外现状及研究意义[J].临床医药实践，2013，22（11）：839840.

[4]倪嘉缵，陈平，刘琼，等.阿尔茨海默病的防治策略研究进展[J].深圳大学学报（理工版），2013，30（4）：331348.

[5]吴志英，孙一忞.阿尔茨海默病的基因诊断：现状和展望[J].诊断学理论与实践，2009，8（04）：372375.

[6]黄越，马建芳，黄山.阿尔茨海默病基因学研究进展[J].中国现代神经疾病杂志，2010，10（02）：171176.

[7]杨小惠，吴芹，石京山.ApoE4在阿尔茨海默病中的研究进展[J].临床与病理杂志，2017，37（03）：627631.

[8]张雪梅，刘秉文.载脂蛋白E研究进展[J].中国动脉硬化杂志，2001（02）：165168.

[9]吴志国，冯莉，肖波.阿尔茨海默病pcDNA3.1/APP595/596质粒的构建研究[J].中国现代医学杂志，2010，20（14）：21462149.

[10]郭宗明，魏农，陈莉.老年阿尔茨海默病患者相关基因检测与分析[J].中国老年学，2016，36（20）：51685169.

基金项目：苏州市高职高专院校教改项目（2017SZJG015）

作者简介：覃鸿妮（1983），女，土家族，湖北长阳人，博士，讲师，苏州工业园区服务外包学院生命科学系主任，研究方向为分子生物学。