利血平预处理抑制低频电刺激对大鼠脑组织Hsp-70和c-fos水平的上调

俞发荣，陈望军，王春梅，谢明仁，连秀珍，李登楼，杨博，郭蕴萱

（甘肃政法学院，甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室，兰州 730070）

当人体受到外界环境压力刺激时，刺激信号通过下丘脑-垂体-肾上腺轴,使交感神经兴奋，促进去甲肾上腺素、肾上腺素的分泌。去甲肾上腺素、肾上腺素作用于神经细胞膜受体，激活腺苷酸环化酶，催化腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成环-磷酸腺苷（cAMP），cAMP激活蛋白激酶A（PKA），继而发生细胞反应，引起神经元细胞核内的快速反应基因（c-fos）和热休克蛋白-70（Hsp-70）的表达。通过检测c-fos和Hsp-70表达量可分析判断应激损伤的程度。本文用低频电刺激作为应激刺激原，利血平作为干预措施，观察利血平对低频电刺激引起的应激的影响，为进一步研究预防应激损伤提供实验依据。

材料与方法

1 实验动物和实验环境

SPF级Wistar大鼠，雄性，30只，体重（190±5）g[甘肃中医药大学科研实验中心，生产许可证号：SCXK （甘）2015-0001]；实验环境：SPF级动物实验室[甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室，使用许可证号：SYXK （甘）2015-0006]。

2 仪器和试剂

Dossy-2H电生理参仪（成都达硕生物科技有限公司）； MK3-酶标仪（上海仪器有限公司）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；Olympus生物显微镜（上海赖氏电子科技有限公司）；ZQP-86型振动切片机（上海之信仪器有限公司）；c-fos和Hsp-70 免疫组织化学试剂盒、ELISA试剂盒（博士德生物科技有限公司）；利血平（广东邦民制药厂有限公司）。

3 低频电刺激

全部动物在SPF级实验室IVC饲育笼内饲养（笼内温度23℃±1℃，湿度55%），适应7d。随机将动物分为对照组：自由饮水、取食，不给电刺激；电刺激组：给予电刺激（频率30 Hz，电流强度5 mA，电压8V，脉冲宽度0.3ms，每次刺激3s，连续刺激3次），自由饮水、取食;利血平组：按利血平半数致死量（LD50）的1/100（用无菌水配制，2mg/100ml），灌胃（2ml/100g体重），次日给予电刺激（同电刺激组）。每组10只大鼠。

4 脑组织采集和检测

动物电刺激后90min，用乙醚吸入麻醉，无痛打开颅腔，取脑，放入含4%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）固定液固定24h，参照大鼠脑立体定位图谱[1]，切取大脑前额叶皮质（PFC）、中脑腹侧背盖区（VTA）、海马（Hipp）组织用振动切片机切片，片厚10µm。切片按免疫组化试剂盒说明书操作，显色后在显微镜下观察、照相；再称取上述脑组织各5mg，研磨成匀浆，3000 r/min离心20min，取上清分别按ELISA试剂盒说明操作，检测脑组织中Hsp-70、c-fos表达水平。对照组动物脑组织采集和检测方法相同。

5 直线回归方程制作

分别以Hsp-70、c-fos标准液浓度为横坐标，吸光度（OD）为纵坐标做标准曲线和标准曲线的直线回归方程，将检测脑组织样本OD值代入直线回归方程，计算出相应的浓度。

6 统计学处理

采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计学处理。电刺激对Hsp-70、c-fos表达水平的影响程度用百分比表示,组间差异用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 低频电刺激对脑组织中Hsp-70表达的影响

ELISA法检测，给予Wistar大鼠电刺激后，大脑额叶皮质Hsp-70水平比对照组升高1116.67%，中脑腹侧背盖区Hsp-70水平比对照组升高1105.24%，海马Hsp-70水平比对照组升高1013.76%；给予利血平后再给予低频电刺激，Hsp-70水平比对照组有所升高，但显著低于电刺激组（图1）。

免疫组织化学检测发现，电刺激组大脑额叶皮质（PFC）、中脑腹侧背盖区（VTA）、海马（Hipp）中Hsp-70阳性细胞数比对照组显著增多，利血平组上述3个脑区中Hsp-70阳性细胞数比对照组高，但低于电刺激组（图2）。

2 低频电刺激对脑组织中c-fos表达的影响

ELISA法检测显示，大脑额叶皮质c-fos水平（14.39±2.36）比对照组（2.69±0.22）升高434.94%，中脑腹侧背盖区c-fos水平（26.42±5.31）比对照组（5.09±0.34）升高419.06%；海马c-fos水平（27.30±6.17）比对照组（5.89±0.41）升高363.49%，给予利血平后再给予低频电刺激，c-fos水平比对照组有所升高，但比电刺激组低（图3）。

图2 电刺激对大鼠脑组织Hsp-70表达的影响。比例尺： PFC，20µm；VTA， 10µm；Hipp， 20µmFig.2 Effect of electrical stimulation on HSP-70 expression in rat brain tissues.Scale bar∶ PFC, 20µm; VTA, 10µm; Hipp, 20µm

图3 电刺激对大鼠脑组织c-fos水平的影响。与对照组比，*，P＜0.05,**，P＜0.01Fig.3 Effects of electrical stimulation on c-fos level in rat brain tissue.*,P＜0.05,**, P＜0.01 vs control group

免疫组织化学检测显示，电刺激组大脑额叶皮质（PFC）、中脑腹侧背盖区（VTA）、海马（Hipp）中c-fos阳性细胞数比对照组显著增多，利血平组上述3个脑区中c-fos阳性细胞数比电刺激组明显减少(图 4)。

讨 论

突发性死亡是严重威胁人类健康的重大疾病之一。近年来，国内外学者对外界刺激引起立即早期基因（如c-fos）和Hsp-70等基因表达进行了实验研究，以期从基因水平探索突发性死亡的机制，寻找新的防治方法和措施，为临床预防和救治应激损伤提供参考。c-fos基因是存在于正常神经元细胞核内的快速反应基因，是联系细胞生化改变与细胞对刺激发生特异性反应的中介物，又称为第三信使[2]。cfos基因的表达产物c-fos蛋白被作为神经元活动变化和伤害性的标志。麻醉剂使大鼠大脑皮质内c-fos蛋白显著增加[3]，艾灸使小鼠大脑皮层、海马组织cfos蛋白的表达明显升高[4]。机体缺水[5]、缺氧[6]、缺血[7]或受磁刺激[8]、电刺激后c-fos基因表达显著增强[9]。当细胞受到外界环境因素刺激时，Hsp-70迅速大量合成，与细胞内变性的蛋白结合，帮助变性蛋白恢复或将变性蛋白运送到溶酶体降解，起到细胞自身保护作用[10]。近年的研究显示，生理和情绪应激与Hsp-70的表达关系密切，心理生理性应激可以诱导大鼠海马组织Hsp-70表达[11]，针疗[12]、电刺激[13]、脑组织缺血[14]、冷[15]、热[16]刺激、化学试剂[17]、重金属[18]等均可引起Hsp-70 的合成和释放。Hsp-70不仅具有显著的神经保护活性，而且参与γ-氨基丁酸（GABA，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质）的调节过程，从而维持中枢神经系统的兴奋-抑制平衡。利血平属于肾上腺素能神经抑制剂，能阻断神经末梢内囊泡单胺转运体的形成，使突触前神经末梢产生的去甲肾上腺素等物质在未受保护的情况下被细胞质中的单胺氧化酶（MAO）、儿茶酚邻位甲基转移酶（COMT）代谢耗竭，使交感－肾上腺髓质轴的兴奋降低，缓解了应激损伤程度，对机体有保护作用[19]。本文实验结果表明，给予大鼠低频电刺激，大鼠脑组织中Hsp-70和c-fos水平显著升高，实验结果与上述文献报道结果一致，说明低频电刺激可引起应激，并通过上调Hsp-70和c-fos水平以产生保护作用。先给予利血平，再给予低频电刺激，大鼠脑组织中Hsp-70和c-fos水平比单给电刺激组显著降低，表明利血平干预低频电刺激对脑组织应激损伤的作用是通过降低或耗竭去甲肾上腺素等物质实现的，去甲肾上腺素参与应激损伤过程[20]。

图4 电刺激对大鼠脑组织c-fos表达的影响。比例尺：PFC, 10µm；VTA, 10µm；Hipp, 20µmFig.4 Effect of electrical stimulation on c-fos expression in rat brain tissues.Scale bar∶ PFC, 10µm; VTA, 10µm; Hipp, 20µm

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