拟南芥Mo敏感突变体基因克隆及功能分析

杜亚琳，陈海燕，郝 宁，藤原徹，武 涛

(1.东北农业大学，农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002；3.东京大学 农学与生命科学学院 应用化学系，东京 都文京区 113-8657)

钼(Mo)是有机体内重要的微量元素[1-3]。当Mo浓度低于0.2 mg/kg时，植物会缺Mo，而Mo浓度高于6 mg/kg会产生毒性[4-5]。土壤pH值是影响钼酸盐生物利用度的重要因素之一，当pH值低于5.5时，钼酸盐同化作用受到抑制[6]。为弥补钼的缺乏，2种高效的方式是施钼酸盐肥和增加pH值。关于钼酸盐毒性的症状已经有报道，如叶片颜色和色素变化以及生长减弱等[6-7]。目前，关于Mo作为有机嘌呤复合体的组成部分的生物学作用已被阐述[6，8-10]。然而，关于Mo毒性的研究报道却很少。

当环境发生变化时，植物的基因表达也会随之发生改变[11-12]。目前，已经鉴定出维持Mo平衡过程中的许多重要转运蛋白，如MOT1和MOT2。钼酸盐转运蛋白MOT1已经从拟南芥中鉴定出来，它参与Mo缺乏条件下的Mo吸收和转运[13]。转运蛋白MOT2定位于液泡上，并参与将储存的钼酸盐从液泡输出到细胞质中，然后转运到成熟的种子中的过程[14]。与硫酸盐转运蛋白家族不同，另一个衣藻MOT2蛋白是促进因子超家族的主要成员[15]，表明钼酸盐在植物中存在不同并且复杂的代谢机制。

1 材料和方法

1.1 植物材料和生长条件

EMS诱变的Columbia(Col-0gl1-1)种子购自Lehle Seeds(目录号M2E-01A-07(201B))。通过TAIR网站(www.arabidopsis.org)的ABRC中订购AtRPI基因CS16363(rsw10-1)中的点突变纯合品系的种子。F1种子来源于4-10和rsw10-1之间的杂交。将种子播种在MGRL生长培养基上[16]，然后将植株在22 ℃，16 h光照/8 h黑暗光周期的条件下培养。

1.2 突变体的鉴定和候选基因定位

在170 nmol/L Mo(1 Mo)MGRL培养基上共生长26 000个EMS诱变的M2种子。将短根的植株转移到340 μmol/L Mo(2000 Mo)MGRL培养基中，并标记根尖的位置。5 d后，将在2000 Mo条件下根伸长恢复的植株再次转移到1 Mo培养基中培养5 d，选择其根伸长停止或缓慢的植物，并获得M3种子。将M3种子播种到1 Mo和2000 Mo培养基上并确认表型。第2次筛选后，获得突变体4-10。

1.3 基因序列测定

使用RNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)从叶片中提取总RNA。然后将RNA反转录为cDNA(PrimeScript RT试剂盒)，并用于基因克隆。回收PCR产物用于测序。引物序列见表1。

表1 基因克隆所需引物序列Tab.1 The primers for gene cloning

1.4 Mo含量测量

对1 Mo和2000 Mo条件下生长14 d的Col-0和4-10植株的根和地上部分分别进行取材，并用浓硝酸消化。然后将样品溶解在0.08 mol/L HNO3中，并通过ICP-MS(SPQ9700；SⅡ，Chiba，Japan)进行Mo含量的测定。

1.5 根形态分析

植株在1 Mo和2000 Mo条件下，用体式显微镜(SZH10；Olympus)分析其根部形态。通过共聚焦荧光显微镜(FV-1000；Olympus)用PI(10 mg/mL；Molecular Probes)对生长14 d的幼苗根部进行根尖观察，激发和发射波长分别为619，559 nm。每个株系超过10株植株进行分析。

1.6 尿苷敏感性测定

为了检测4-10突变体和Col-0植株对尿苷的敏感性，将种子播种在含有1 Mo和5 mmol/L尿苷的组合培养基上。

1.7 根长测量

使用软件ImageJ(http：//rsb.info.nih.gov/ij/)对生长10 d的植株根长进行测定，数据以平均值±SD表示。每种条件下至少测量30株植株。

1.8 花青素测量

2 结果与分析

2.1 Mo敏感突变体4-10的鉴定

为了在正常的Mo条件下鉴定出新的突变体，本研究将EMS诱变的M2种子(共26 000个种子，Col-0 gl1-1)播种到170 nmol/L Mo(1 Mo)培养基上，选择根伸长发育受到抑制的植株并转移到340 μmol/L的Mo(2000 Mo)培养基中培养5 d，将具有根长恢复的植株再次转移到1 Mo培养基中培养5 d，选择根停止伸长或伸长发育缓慢的植株，单株收种得到M3种子。将M3种子播种到1 Mo和2000 Mo培养基上，选择生长有差异的株系。经过筛选后，获得了一个编号为4-10的突变体(图1-A)。根长测量结果表明，在1 Mo条件下，4-10和Col-0幼苗的根长分别为(1.56±0.13)cm和(11.89±0.71)cm；而在2000 Mo条件下，4-10和Col-0的根长分别为(3.3±0.17)cm和(6.8±0.73)cm(图1-B)。

此外，4-10异常的根形态可以通过340 μmol/L的Mo处理后得到恢复(图2)。而在1 Mo和2000 Mo条件下，4-10的地上部分表型与Col-0中观察到的表型没有区别，这与地上部分鲜质量测定结果一致。

A.在不同Mo条件下生长的Col-0、4-10植株；B. Col-0和4-10植株的根长。不同字母表示基于Tukey测试的0.05水平上的显著差异。图3，5同。A. Col-0，4-10 seedlings grown in different Mo conditions；B. Root length of Col-0 and 4-10 seedlings. Different letters represent significant differences at the 0.05 level based on Tukey′s test.The same as Fig.3，5.

A～D. 过量Mo对Col-0和4-10植株初生根形态的影响；E～H. 过量Mo条件下Col-0和4-10根尖形态。A-D.Effects of excess Mo on primary root morphology of Col-0 and 4-10 plants；E-H.Effects of excess Mo on root tips of Col-0 and 4-10 seedlings.

A. Col-0和4-10植株在条件下表型；B. Col-0和4-10植株在条件下花青素相对含量。A. Col-0 and 4-10 seedlings grown under conditions；B. Relative anthocyanin contents of Col-0 and 4-10 plants grown under conditions.

2.2 Mo过量和敏感突变体4-10的基因克隆

A.4-10突变体候选基因精细定位；B.4-10突变体的测序区域；C.RPI中的点突变位置的示意图；对植株生长的影响；E. 尿苷对植物生长的影响。A.Fine mapping of candidate genes of 4-10 mutant；B.Sequenced region of the 4-10 mutant；C.Schematic diagram of point mutation position in RPI；D.Effect of on plant growth；E.Effect of uridine on plant growth.

2.3 RPI的突变影响4-10植株体内Mo动态平衡

植物具有感知内部和外部Mo状态的能力，然后通过基因表达的改变来适应Mo条件的变化。为了确定4-10突变体的Mo敏感性是否发生了变化，测定了在1 Mo和2 000 Mo条件下4-10植株细胞中的Mo含量。结果表明，在1 Mo和2 000 Mo条件下，4-10突变体根中Mo含量显著低于Col-0(图5A)；在1 Mo条件下，4-10和Col-0植株根系Mo含量(以干质量计)分别为(2.8±0.31)mg/kg和(4.2±0.28)mg/kg(图5)；在2 000 Mo条件下，4-10和Col-0的根Mo含量分别为(1 000±112.92)mg/kg和(1 600±110.93)mg/kg(图5)。在1 Mo条件下，Col-0和4-10突变体植株的地上部位中Mo含量没有显著差异(图5-A)，在2 000 Mo条件下，4-10突变体地上部Mo含量显著高于Col-0(图5-B)。根中Mo含量的改变表明，RPI的突变参与了Mo的稳态途径而不是感应/信号转导。为了证实这种假设，应该通过测定Mo稳态中涉及的几个基因(如MOT1、MOT2等)的mRNA水平来对4-10突变体植株进一步分析。

图5 4-10突变体植株根系Mo浓度低于Col-0Fig.5 Seedlings of 4-10 mutant had a lower root Mo concentration than that of Col-0

3 讨论

参考文献：

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