野生胡麻愈伤组织诱导及其对NaCl胁迫的生理响应

刘 风，赵 玮

（1.甘肃省农业科学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业科学院作物研究所，甘肃 兰州 730070）

胡麻（油用亚麻）属于亚麻科（Lianceace）亚麻属（Linum）［1］，主要分布在甘肃、内蒙、宁夏、山西、河北等省区［2］。胡麻油富含α-亚麻酸及各种人体必需的不饱和脂肪酸，具有促进智力发育、强身健脑、降血脂、预防血栓等作用，是我国工业用干性植物油和产区群众主要的食用油来源［3-4］。此外，胡麻籽中木酚素质量分数很高，这种物质被人体吸收后，可以抑制癌症，特别是能降低乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发病率。胡麻籽中还富含可溶性植物纤维素，具有降低胆固醇的作用，经常食用胡麻籽，可以降低便秘、肥胖、心脏病等发病率［5］。

野生胡麻主要生长在海拔1 500～2 000 m的高寒山区，为多年生草本植物，果小粒小易落粒，具有抗旱、抗寒、耐瘠薄、分茎多、生育期短的特性，是良好的抗逆性种质资源。野生胡麻种子休眠性强，用常规方法很难繁殖成功，进行种质资源保存颇有难度，不便于育种和遗传利用研究。近年来，有关野生胡麻组织培养技术研究的报道不多，前期的研究多集中在培养基激素配比、外植体取材对栽培胡麻愈伤组织和胚状体诱导以及再生植株分化的影响等方面。赵玮等［6］研究优化的栽培胡麻组织培养最佳培养基配方为MS+NAA（0.5 mg/L）+6-BA（1.5 mg/L）， 最适宜的外植体为下胚轴；颉瑞霞等［7］发现KT+2，4-D激素组合对胡麻花药愈伤组织的诱导效果优于KT+NAA；孙上峰等［8］通过对胡麻花药的各种预处理的研究，发现不同基因型在同一处理内有不同的出愈率，同一基因型在不同预处理条件下有不同的出愈率；姬妍茹等［9］对野生亚麻的茎段进行无性扩繁获得成功，初步确定MS（附加6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.05 mg/L）为茎段分化的适宜培养基，1/2MS（附加一定量的激素）培养基为不定芽保存培养基。

了解植物的耐盐机理，研究盐胁迫条件下植物的生理生化变化，对发展盐碱地农业，缓解粮食压力具有重要的实践意义［10］。目前抗盐生理在胡麻领域相关研究很少。赵玮等［11］分析了不同浓度的NaCl胁迫下不同抗旱性胡麻品种苗期和成株期农艺性状以及SOD、POD、MDA质量分数，结果表明，抗旱性强的胡麻品种同样具有更强的耐盐特性。本研究通过筛选最佳野生胡麻愈伤组织诱导培养基，继而将愈伤进行不同浓度NaCl胁迫，分析愈伤增殖率及其生理特性，从而筛选出优质野生胡麻资源，为抗逆胡麻优良品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试野生胡麻种质资源共8个，分别为乌兰察布蓝花、乌兰察布红花、张家口蓝花、定西蓝花、兰州蓝花、平凉蓝花、临洮蓝花、会宁蓝花，均由甘肃省农业科学院作物研究所品种资源研究室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 愈伤组织诱导培养基：在MS培养基上分别添加NAA质量体积分数为0、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L，6-BA质量体积分数为0、0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mg/L， 编号为 LM1～LM25（表1）。NaCl胁迫愈伤组织培养基：用筛选出的最佳愈伤诱导培养基配方为基础，分别添加NaCl溶液0（CK）、50、100、 150、 200、 250 mmol/L 各 50 mL 于250 mL三角瓶中进行悬浮培养。

1.2.2 材料处理与指标测定 愈伤诱导：将野生胡麻种子分别用70%的酒精表面杀菌30 s，再用0.1%的HgCl2消毒5～6 min，用无菌蒸馏水冲洗4次，然后接种于含有40 mL的MS培养基三角瓶中。每瓶20粒，待其萌发5 cm后剪切下胚轴1 cm作为外植体，分别接种于装有不同激素配比浓度培养基的三角瓶中，每瓶接种5个外植体，每组10瓶，3次重复。观察并记录不同激素配比对愈伤组织诱导影响。

NaCl胁迫愈伤组织：筛选出野生胡麻愈伤组织块，分别接种于装有不同NaCl胁迫浓度培养基的三角瓶中，每瓶接种5块愈伤，每组10瓶，3次重复。记录初始重量和愈伤组织状态，培养40 d后观察并记录不同浓度NaCl胁迫对愈伤组织增殖的影响。

生理指标测定：通过不同浓度NaCl胁迫，筛选耐盐型和敏感型野生资源愈伤组织，分别进行SOD、CAT、POD、MDA等生理指标测定，分析野生胡麻愈伤组织对NaCl胁迫的生理响应。

1.2.3 培养条件 愈伤诱导培养为黑暗培养、温度（23±2）℃。待胚状体长出、进入分化阶段时进行光照培养，光照强度1 500～2 000 Lx，光照时间16 h/d，温度（23±2）℃。愈伤盐胁迫为液态悬浮培养［12］：于120 r/min的恒温旋转摇床上培养，温度27～28 ℃，全程暗培养7 d后用新鲜液体培养基更换瓶中2/3的培养液，持续培养40 d［13］。

表1 愈伤组织诱导培养基

1.3 测定指标及计算方法

愈伤组织诱导结果通过愈伤诱导率和愈伤组织增殖率体现，计算公式如下。

愈伤诱导率（%）=（产生愈伤组织外植体数/接种外植体数）×100%；

愈伤组织增殖率（%）=［（培养后愈伤总重-培养前愈伤总重）/培养前愈伤］×100%；

相对盐害率＝［（对照愈伤增殖率－处理愈伤增殖率）/对照愈伤增殖率］×100%。

SOD酶活力指数=（SOD抑制率/2）×（反应体系稀释倍数/测定样本蛋白浓度）

CAT活力指数=［（对照OD值-测定OD值）×271］/60×取样量/待测样本蛋白浓度

POD活力指数=［（测定OD值-对照OD值）/（12×比色光径）］×反应液总体积/取样量/反应时间/匀浆蛋白浓度×1 000

MDA含量=（MDA浓度×提取液体积）/植物组织鲜重

2 结果与分析

2.1 野生胡麻愈伤组织诱导培养基筛选

在MS培养基上添加不同激素配比的结果（表2）显示，不同野生胡麻种质愈伤组织的诱导率差别较大。LM19号培养基MS＋NAA（0.15 mg/L）＋6-BA（1.5 mg/L）对所有供试野生种质平均愈伤诱导率在所有处理中最高，达到39.77%。其中乌兰察布蓝花愈伤诱导率最高，为90.00%；乌兰察布红花愈伤诱导率最低，只有13.50%。不同野生胡麻在LM19号培养基上的愈伤诱导率从大到小依次为乌兰察布蓝花、张家口蓝花、定西蓝花、平凉蓝花、会宁蓝花、兰州蓝花、临洮蓝花、乌兰察布红花。

2.2 NaCl胁迫对野生资源愈伤耐盐性评价

不同NaCl浓度胁迫下野生胡麻品种资源愈伤相对伤盐害率结果（表3）显示，随着胁迫浓度的增加，所有种质的平均盐害率均为增长趋势，NaCl浓度为250 mmol/L时平均盐害率为96.29%，其中乌兰察布红花、定西蓝花、平凉蓝花、临洮蓝花等4份种质盐害率达到100%；乌兰察布蓝花的盐害率为78.42%，在所有供试材料中最低。以NaCl浓度为200 mmol/L时的相对盐害率结果作为野生胡麻资源耐盐性评价标准，得出野生胡麻资源耐盐性由大到依次为乌兰察布蓝花、定西蓝花、会宁蓝花、兰州蓝花、张家口蓝花、平凉蓝花、临洮蓝花、乌兰察布红花。对愈伤组织长势的观察结果表明，耐盐性强的野生胡麻资源愈伤组织长势更强，愈伤组织致密、颜色深绿、成团性好，而敏感型资源普遍较疏松，颜色清淡、玻璃化严重。

表2 不同激素配比愈伤组织诱导率 /%

表3 不同NaCl浓度胁迫下相对盐害率 /%

2.3 NaCl胁迫对野生胡麻愈伤SOD活性的影响

SOD是生物体内清除自由基的首要物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，其活性的高低变化反映了植物对氧化损伤的修复能力［14］。将耐盐型野生胡麻种质乌兰察布蓝花和敏感型野生种质乌兰察布红花愈伤组织进行生理指标测定。通过图1可以看出，随着NaCl浓度增加，乌兰察布蓝花和乌兰察布红花2种野生胡麻愈伤SOD质量分数均呈相同变化趋势，并且SOD活性均在NaCl浓度为250 mmol/L时达到峰值，其中敏感型野生胡麻乌兰察布红花最高值为对照的1.66倍，耐盐型胡麻种质乌兰察布蓝花最大值为对照的1.65倍。

图1 不同浓度NaCl胁迫下野生胡麻愈伤SOD活性

2.4 NaCl胁迫对野生胡麻愈伤CAT活性的影响

CAT和SOD都能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，其活性的高低变化同样反映了植物对氧化损伤的修复能力［15］。通过图2可以看出，随着NaCl胁迫浓度的增加，耐盐型野生胡麻乌兰察布蓝花平均CAT质量分数高于敏感型野生胡麻资源乌兰察布红花1.73倍。敏感型野生胡麻CAT质量分数在NaCl浓度150 mmol/L胁迫下达到最高值，为对照的3.35倍；耐盐型资源在NaCl浓度200 mmol/L胁迫下达到最高值，为对照的5.21倍。

图2 不同浓度NaCl胁迫下野生胡麻愈伤CAT活性

2.5 NaCl胁迫对野生胡麻愈伤POD活性的变化特征

POD是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，可清除植物体内SOD催化反应的产物过氧化氢，从而使需氧生物体免受过氧化氢的毒害［16］。从图3可以看出，不同浓度NaCl胁迫后，敏感型野生胡麻乌兰察布红花POD质量分数在NaCl浓度为50 mmol/L时达到最高，为对照的2.15倍；NaCl浓度为250 mmol/L时POD质量分数与对照相当。耐盐型种质的POD含量总体呈现上升的趋势，且在NaCl浓度为250 mmol/L时POD含量达到最大值，为对照的1.79倍。

图3 不同浓度NaCl胁迫下野生胡麻愈伤POD活性

2.6 NaCl胁迫对野生胡麻愈伤MDA含量的变化影响

丙二醛（MDA）的质量分数代表植物膜脂过氧化的水平，反映植物受伤害的程度［17］。通过图4可以看出，不同浓度NaCl胁迫下两类野生胡麻愈伤组织MDA质量分数均出现增加的趋势，当NaCl胁迫达到200 mmol/L时，两类野生种质的愈伤MDA质量分数均达到最大值，其中敏感型MDA最大含量是对照的13.00倍，耐盐型MDA最大含量为对照的2.50倍。

图4 不同浓度NaCl胁迫下野生胡麻愈伤MDA活性

3 结论与讨论

对野生胡麻培养基配方的优化结果显示，不同激素配比对野生胡麻愈伤的诱导有显著差异，其中乌兰察布蓝花愈伤诱导率最高，乌兰察布红花愈伤诱导最低，其原因一是红花野生胡麻种子萌发率低且作为愈伤诱导外植体材料的下胚轴生长较为细弱，愈伤组织普遍疏松，颜色清淡、玻璃化严重，从而影响愈伤诱导。二是目前大田栽培品种以蓝花为主，赵玮等［11］通过对栽培品种陇亚10号的组培诱导发现其愈伤诱导较为容易，且最高可达100%。因此，蓝花野生种质可能具有和栽培品种相似的高愈伤诱导结果。

不同浓度NaCl胁迫下各种野生资源愈伤相对盐害率均为增长趋势。在NaCl浓度为250 mmol/L时平均盐害率为96.29%，其中有4份种质盐害率达到100%，所以此浓度下的结果已不具有评价各种资源耐盐性意义，故选择NaCl浓度为200 mmol/L时的相对盐害率结果作为野生胡麻耐盐性评价依据。从观察结果来看，愈伤诱导率高的野生种质长势更强，愈伤更加致密、深绿，相对含水量比疏松、玻璃化的愈伤低，受到盐害时具有更高的防御性，如乌兰察布蓝花愈伤诱导率和耐盐性均为首位，而乌兰察布红花愈伤诱导率和耐盐性均位列最后。

在盐分胁迫条件下，膜系统的变化首先表现为盐分对膜系统的破坏，也反映其对盐分的忍耐程度，然后是植物对膜系统的修复。膜系统的修复与SOD、CAT和POD酶活性的升高是分不开的［18］。本研究显示，当受到不同浓度NaCl胁迫下耐盐型野生种质较敏感型种质愈伤组织含有较高的SOD和CAT质量分数。敏感型野生胡麻的CAT含量在NaCl浓度为150 mmol/L时达到最高，之后迅速下降；而耐盐型野生资源含量在NaCl浓度为200 mmol/L时达到最高，且下降幅度明显平缓，表明其CAT对膜系统的修复能力和持续性更强。敏感型种质POD质量分数变化趋势为先上升后降低，NaCl浓度为50 mmol/L时POD质量分数达到最高值，表明敏感型野生胡麻的愈伤组织对于NaCl胁迫更为敏感，而随着NaCl浓度的增加POD自生的保护性酶浓度越来越低，发挥的作用越来越小。耐盐型野生资源POD质量分数总体呈现一直上升的趋势，在NaCl浓度为250 mmol/L时POD质量分数达到最大值。说明POD保护性酶的作用稳定发挥，提高了其对盐害的耐受性。

MDA间接反映膜受损状况，并兼有反馈植物受伤害程度的作用［19］。本研究中，NaCl胁迫下两类野生胡麻愈伤组织MDA质量分数均明显增加，表明两类野生胡麻种质的愈伤组织均受到了一定的伤害，而且随着浓度的增加受伤害更严重。虽然耐盐型野生种质在NaCl胁迫下MDA质量分数平均值远高于敏感型野生种质，但是与无胁迫处理相比，MDA质量分数变化幅度不大，最高值也只有对照的1.83倍；而敏感型野生种质在NaCl胁迫下MDA质量分数发生剧烈变化，最高时为无胁迫处理的15.90倍，表明其细胞膜受损更重。

综上所述，不同野生胡麻种质的愈伤增值率、耐盐性差异性显著。耐盐性野生胡麻愈伤组织在NaCl胁迫下SOD、CAT和POD等酶活性较敏感型更高，MDA含量变化幅度较敏感型小，表明耐盐性种质在盐胁迫下膜细胞受盐害程度相对较小，保护酶修复能力强，保护作用能够更持续稳定发挥。

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