海南不同产地草豆蔻的差异蛋白分析

吴秀丽 王旭初 段红叶 李建玲 何文英

摘 要 草豆蔻為典型的药食同源植物，关于其主要的化学成分已早有研究，但对其含有的植物蛋白却鲜有研究。本研究首次探索了海南地道草豆蔻（白沙和霸王岭2个产地）中所含蛋白信息。应用双向电泳进行蛋白分离得到相应全蛋白图谱，并用Image Master5.0软件比较筛选出不同产地的高丰度差异蛋白，通过基质辅助激光解析-电离飞行时间质谱分析（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrum， MALDI-TOF MS）及Mascot Distiller软件对蛋白进行搜库。结果显示：2个不同产地草豆蔻共有40个高丰度差异蛋白，去除相同的蛋白，经分析确定这些差异蛋白归属22种植物蛋白，主要涉及植物的抗菌活性、应激反应、细胞分裂增殖及对植物物理性状的影响等方面。首次发现某些差异蛋白可能具有一定的抗菌活性，如11、12及13号的类似豌豆的抗菌肽段，7或25号的纤维状细胞分裂蛋白， 24号的泛素蛋白连接酶E3，31号的小分子热休克蛋白，14及35号的谷胱甘肽s-转移酶。这些差异蛋白均与草豆蔻极其主要的活性组份所具有的抗炎抑菌、毒性低等的特点相关。本研究结果不仅是对草豆蔻所含物质中的生物大分子种类的补充和完善，同时也体现了不同产地草豆蔻的生物多样性特点，为深入利用、研究这种药食同源的植物及全面了解其药理活性提供了一定的科学依据。

关键词 海南草豆蔻 ；蛋白图谱 ；差异蛋白

中图分类号 Q949.71+8.33 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.011

Abstract As a typical plant that had the homology of medicine and food， Alpinia Katsumadai had been studied on its main chemical components. But there was few research about vegetable proteins. The protein information of Alpinia Katsumadai in Hainan Baisha and Bawangling were investigated in this paper. The protein profiles of Hainan Alpinia Katsumadai were obtained by 2-dimensional polyacryamide gel electrophoresis （2-DE） technique. The high abundance proteins in different habitats were compared and screened out by software Image Master5.0.The protein database was searched by Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry （MALDI-TOF MS） and the software Mascot Distiller. The results indicated that there were 40 high abundance proteins of Alpinia Katsumadai in two areas. The identical proteins were removed and the identified proteins were assigned to 22 kinds of proteins which related to the antimicrobial activity of plant， stress response， cellular differentiation and proliferation， physical characteristics. Some differential proteins were found to have certain antimicrobial activity.They were antimicrobial peptides of 11， 12 and 13 protein spots， cell division protein FtsZ of 7 and 25 protein spots， E3 ubiquitin-protein ligase of 24 protein spot， 17.7 kDa heat shock protein of 31 protein spot and glutathione S-transferase of 14 and 35 protein spots. These differential proteins were related with the anti-inflammatory and bacteriostasis and low toxicity of Alpinia Katsumadai. This paper filled the information of biomolecules of Alpinia Katsumadai and illustrated the biological diversity features of Alpinia Katsumadai in different habitats. The study may provide scientific basis for further development and utilization of Alpinia Katsumadai and fully understand its pharmacological activities.

Keywords Alpinia Katsumadai ； protein profiles ； differentially expressed proteins

草豆蔻为姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的干燥近成熟种子，具有湿胃止呕、燥湿健脾功效；临床上用于治疗脘腹胀满冷痛、寒湿内阻、不思饮食、暖气呕逆；民间食用方法是作为调料。目前已知草豆蔻主要含挥发油与黄酮类成份，主要活性组份包括黄酮类的山姜素和查耳酮类的豆蔻明，其药理活性主要表现在抑制肿瘤的形成、抑制血小板聚集及抗炎抑菌等的方面，且安全性好，毒性很低[1]。作為一种传统的药食同源品种，国内外对草豆蔻及其主要组份的研究主要集中在成份分析及药理活性方面[2-3]，但应用基于双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）的蛋白质组学方法研究草豆蔻的蛋白图谱及不同地域草豆蔻的差异蛋白却未见报道。尤其近年来，2-DE技术在植物蛋白质组学研究中的应用越来越广泛和深入。Wang等[4-5]、Yi等[6]应用双向电泳技术，通过蛋白分离提取、质谱技术鉴定分析了盐生植物海莲子、海马齿叶、小盐芥叶等的差异显示蛋白；相关学者针对多种作物（木薯、玉米、向日葵、人参等），应用蛋白质组学的方法，通过优化实验条件及方法，研究了不同优化双向电泳条件下的蛋白提取结果，利用质谱鉴定分析了其中的差异蛋白[7-10]。樊帆等[11]分析了清水引发和藤茶提取物二氢杨梅素引发提高水稻劣变种子发芽率的蛋白质组学。李艳霞等[12]就香蕉后熟果皮差异蛋白分析及其基因克隆进行了研究。以上众多研究表明，作为最初聚焦基础研究的蛋白质组学技术，从描述在特定状态或特定时期下，一种生物体的某一细胞或某一组织的基因组所表达的所有蛋白质，及其这些蛋白质的活性或存在方式，到当今应用于直观揭示各种生物体的全蛋白种类及归属，蛋白质组学技术已经实现了其在实际应用领域的拓展[13]。海南以其独特的地理环境条件，在许多地区盛产草豆蔻，利用蛋白质组学技术分析其全蛋白图谱及不同产地草豆蔻的差异蛋白，可获知不同地域、不同环境条件对草豆蔻生命过程的影响情况；从蛋白质水平揭示各种生理过程的分子机理，为补充认识草豆蔻的药效作用、进一步研究开发及利用草豆蔻奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂

蛋白质双向电泳仪（美国通用公司GE Healthcare）；蛋白质单向电泳仪（美国通用公司GE Healthcare）；Image scanner III扫描仪（美国通用公司GE Healthcare）；SIGMA 3-18K低温超速离心机（德国SIGMA）；MultiTemp IV恒温循环器（美国通用公司GE Healthcare）；台式恒温振荡器（上海精宏）；EYELA摇床（东京理化）；涡旋混合器QL-866（海门其林贝尔）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津津腾）；UV-2700紫外分光光度计（日本岛津）；ImageMaster5.0凝胶图像分析软件；Voyager-DE PRO ABI4700时间飞行质谱仪（美国ABI公司）；KQ2200E型超声波清洗器（曙峰企业）。

蛋白Maker（Fermentas预染蛋白Marker 10-170KD，广州翔博生物科技有限公司），牛血清蛋白（美国Simga）。所有实验用水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

1.1.2 草豆蔻样品

经海南师范大学生命科学院的钟琼芯教授推荐可知，海南霸王岭和白沙县境内有一定量的野生草豆蔻，具有典型的地域代表性。在专业采药人的帮助下，于2015年5月采集到了生长于海南霸王岭和白沙县的草豆蔻样品，经海南师范大学生命科学院的钟琼芯教授鉴定确为姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的种子团。

1.2 方法

1.2.1 草豆蔻蛋白样品制备

将当天采集的草豆蔻种子样品附着的杂质用超纯水冲洗干净，分装、标记样品并迅速放入-80℃冰箱储存。利用酚抽提法提取，分别取出冻干的不同产地的草豆蔻种子样品，用液氮和石英砂将草豆蔻种子研磨成粉末；称2 g研磨好的样品粉末，加入7 mL预冷BPP提取缓冲液和7 mL Tris饱和酚，室温涡旋震荡，分别震荡10和5 min，在4 ℃、16 000 g条件下离心15 min；每1 mL上清液加入5 mL预冷过的饱和硫酸铵甲醇溶液（AM沉淀剂），放置-20 ℃沉淀过夜；在4 ℃、16 000 g条件下离心15 min；去除上清液，分别依次加入2 mL的-20 ℃预冷甲醇和2 mL预冷丙酮，搅碎蛋白，在4 ℃、16 000 g条件下离心5 min，各重复2次，去上清液；再将沉淀蛋白室温下自然风干，加入10 μL/mL PMSF，10 mg/mL DTT，混合均匀，再按10 mg样品/mL配制得蛋白裂解液，置于20℃恒温溶解2 h；在20 000 g、20℃条件下离心30 min，分装于1.5 mL离心管，依据Bradford方法测定蛋白浓度[14]，于-20℃保存。

1.2.2 蛋白质含量的测定

标准曲线方程的测定：从储备液中移取0、6、12、18、24、30 μL溶液，用Bradford溶液定容至3 mL，即配制成0、2、4、6、8、10 μg/mL的标准系列浓度；利用紫外分光光度法测定595 nm处吸收值，绘制标准曲线方程。

取3 μL待测蛋白样品用Bradford溶液定容至3 mL，根据Bradford法[14]，使用紫外分光光度计，测定蛋白样品溶液在595 nm处的紫外吸光度值，根据标准曲线方程，计算样品中蛋白质的含量；根据蛋白质定量的结果取适量蛋白液进行后续电泳实验。

1.2.3 单向电泳实验[14-15]

在蛋白质单向电泳仪上进行，采用垂直平板装置，分离胶质量分数12%，浓缩胶为5%。将不同产地的草豆蔻蛋白样品上样，上样量均为30 μg，分别加入6个梳子的进样孔中，每个样品重复3次；蛋白Maker事先煮沸5 min；电泳参数设置为：先以5 W的功率电泳1 h，再改用7 W的功率，当溴酚蓝指示剂迁移至距下沿1.5 cm处停止电泳；取出凝胶，于25℃恒温振荡染色3 h后脱色，并在胶片观察灯下拍照。

1.2.4 2-DE实验[15]

（1）等电聚焦。在一次性水化盘内采用胶内水化方式进行上样，先以20 ℃恒温水化18 h；待水化结束后，再将胶条转移至Ettan IPGphor3聚焦仪上。聚焦程序设置参数为：表面温度20 ℃，电流强度50 μA/胶条，250 V，3 h；500 V，2 h；1 000 V，1 h；1 000～8 000 V，3 h；8 000 V，12 h，分别聚焦至VhT为120 000。

（2）胶条平衡及聚丙烯胺凝胶制备。将等电聚焦结束后的胶条分别置于平衡缓冲液[1 % DTT，6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl （pH 8.8），2 % SDS，30 %甘油，0.002 %溴酚蓝，4 %碘乙酰胺]中，平衡15 min，再在垂直电泳仪上进行双向电泳操作。电泳设置条件为：保持循环水浴温度16 ℃，以5 W/胶进行1 h，再以7 W/胶继续电泳，当溴酚蓝指示剂迁移至距下沿1.5 cm处停止电泳。

（3）凝胶染色和脱色。在500 mL染色液A和500 mL染色液B等体积混合的溶液中进行。其中，染色液A的配方为：甲醇100 mL、考马斯亮蓝G250为1.25 g、乙醇300 mL、ddH2O为100 mL；染色液B的配方为：59 mL 85 %磷酸、100 g硫酸铵。在室温下染色12 h，再进行2次脱色（20 min）（脱色液的配方为：100 mL无水乙酸、600 mL无水乙醇，以ddH2O定容到2 L）。

（4）凝胶扫描和图像分析。采用Image Scanner III扫描仪扫描，用Image Master5.0图像分析软件进行分析，筛选不同产地样品的高丰度差异蛋白点，并挖取这些差异蛋白点，分别放入不同的样品管中。

1.2.5 酶切及质谱测定

（1）酶切。将得到的差异蛋白点先进行脱色处理：分别加入150 μL脱色液（50 % 100 mmol/L NH4HCO3，50 % ACN），以150 r/min转速震荡30 min，吸出脱色液，重复该步骤2～3次，直至胶粒颜色变为透明；再分别加入150 μL ddH2O，重复3次，去除干净样品中的NH4HCO3；加入100%乙腈100 μL，以150 r/min转速震荡15 min，重复2次，直至胶粒变为纯白色，将样品风干；分别加入胰蛋白酶缓冲液6 μL，在PCR儀上酶解13 h（37℃）；将酶解后的蛋白离心（在20℃、10 000 g的条件下离心5 min），收集上层酶解液，转移至干净PCR管中，用于质谱鉴定。

（2）MALDI-TOF MS质谱鉴定及蛋白数据库搜索。在ABI 4700时间飞行质谱仪上进行质谱鉴定。设置参数：Nd为YAG激光器，335 nm，200 Hz激光激发。将所得的质谱数据通过Mascot Distiller软件进行分析，在Matrix Science网站（http：//www.matrixscience.com）输入数据进行搜索比对，获得各差异蛋白的名称及序列等信息。

2 结果与分析

2.1 草豆蔻蛋白单向电泳图谱分析

为优化双向电泳的实验条件，首先需要进行单向凝胶电泳的检测，以确定所提取的草豆蔻种子蛋白质是否会降解。图1为不同产地草豆蔻和标准蛋白的标记样品单向电泳图，使用NL pH3-10的24 cm IPG胶条，455 μL上样体积中蛋白量为1 300 μg。从图中可以看出，2个产地的蛋白图谱非常相似，暗示其具有相似的蛋白或分子量；与标准蛋白相比，2个产地的蛋白质条带清晰，证明草豆蔻蛋白质没有降解，且干扰杂质含量较少，可以进行双向电泳。从分子量的分布看，2个产地的草豆蔻所含蛋白质分子量主要介于20～60 ku，这与后续的双向电泳实验结果相一致，但由于本实验所用的是非线性胶条（pH3-10），故一些特征碱性蛋白可能会被漏检。

2.2 草豆蔻蛋白双向电泳图谱分析

采用酚抽提法，将海南霸王岭和白沙2地产的草豆蔻种子进行优化处理，除去挥发油等杂质，得到纯度比较高的蛋白样品，并获得蛋白图谱（图2，3），其中图2为霸王岭草豆蔻蛋白2-DE图识别626蛋白点（重复3次平均值），图3为白沙草豆蔻蛋白2-DE图识别670蛋白点（重复3次平均值）。从图中可看出，2种草豆蔻种子的蛋白表达图谱非常相似，蛋白点多集中在pH 4～7。用Image Master5.0图像分析软件在等电点为4.0～10.0、分子量为14.4～97.4 ku的图谱上，将霸王岭和白沙2个产地草豆蔻的蛋白图谱进行比较分析，自动检测结合人工去除，分别保留高清晰且重复性强的蛋白点，两者匹配率大于85 %，可作为差异蛋白；通过进一步分析对比，共获得40个差异蛋白点。对40个高丰度蛋白质点进行质谱测定，确定所属的蛋白质，结果显示1～20号为霸王岭草豆蔻蛋白点，21～40号为白沙草豆蔻蛋白点（表1）。表2为从差异蛋白中所检测到的肽段序列及其占目标蛋白多肽序列的百分比和分值等信息。

2.3 差异蛋白的功能分析

通过比较2个不同产地的蛋白图谱及高丰度差异蛋白可知，其相似点是：不同产地的草豆蔻2-DE图谱较相似；这些高丰度差异蛋白绝大多数均在其他植物中有存在，涉及植物生长发育过程中的不同功能。不同点是：霸王岭草豆蔻蛋白与白沙的有较多重叠，但白沙的更为独特些。从表1中显示的海南霸王岭和白沙草豆蔻的高丰度差异蛋白看，除了10号蛋白点通过分析被鉴定为Papilio polytes（玉带凤蝶）中所含蛋白，其他的39个蛋白点都归属为植物蛋白。由于玉带凤蝶为常见凤蝶属物种，寄主植物多为木兰科植物和芸香科植物[16]，推测海南草豆蔻可能为玉带凤蝶的一种寄主植物，因此造成对草豆蔻样品的污染。针对表1中有确切名称的蛋白，做如下简要的功能分析。

1号蛋白点属锌指蛋白类，植物的锌指蛋白通过特殊的富含精氨酸结构域的一类蛋白过表达，从而影响植物的激素调控、生长发育、应激反应及转录后基因表达等。众多研究已表明，锌指蛋白可通过基因表达控制种子的发芽、植物的表型、开花的时间、生命及非生命体的压力反应等[17]。

7或25蛋白点属纤维状细胞分裂蛋白，属具有鸟苷三磷酸酶活性的高度保守的真核细胞分裂蛋白，它存在于多种细菌的细胞壁，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、无胆甾原体、盐沼盐杆菌、热细菌、结核杆菌甚至古生菌域等的细胞壁，是有望发现新一代抗菌药物的新靶标[18]。

11、12及13号蛋白点为类似豌豆的抗菌肽段，近年来，由于抗菌肽段具有广谱和快速抗菌的效果，已引起了研究者的广泛关注，尤其是抗菌肽段能针对抗药性病原菌，与传统的抗生素类药物起协同作用。从其结构看，抗菌肽段具有多样性序列，含有大量带负电荷的疏水氨基酸残基（磷脂双层结构），有助于选择性地抵抗致命性病菌。有些抗菌肽段通过非膜透化机制，不经过细胞质膜而直接作用于细胞内靶标。除了以上所表现的直接抗菌活性，抗菌肽段还能抑制菌膜的形成及破坏成熟的菌膜。此外，抗菌肽段这种多功能生物大分子还具有多样性的免疫调节性质，比如对趋化因子表达的修饰、促进伤口愈合及血管生成、降低促炎调节等，以此来对细菌内毒素（脂多糖和脂磷壁酸）作出应激反应[19]。

14及35号蛋白点为谷胱甘肽s-转移酶（Glutathione S-transferase，GSTs），在原核生物及真核生物（高等植物、昆虫和哺乳动物）中广泛存在。其主要生物学功能为解毒作用，解毒的对象主要包括除草剂、农药、诱变剂和致癌物等。对植物体内GSTs的研究从20世纪70年代对玉米抗除草剂阿特拉津的研究开始，随后逐渐在高粱、大豆、甘蔗、烟草、豌豆等作物及高等植物体内相继发现了GSTs的活性，尤其在高等植物中，GSTs在植物体抵御外源物質伤害或对多种逆境的应激抗性中均发挥重要的作用；也有研究表明，GSTs的活性还涉及植物对热激作用、病原菌因子、重金属离子及外源植物激素的抵御抗毒作用，并且这些作用正日益受到研究者的重视[20]。

15号蛋白为硫酸盐转运蛋白，硫是植物生长发育所必需的大量元素之一，它不仅对植物有直接的营养作用，还可以提高植物的水分利用率，有利于植物对干旱逆境的适应。通过核酸序列研究发现，植物硫酸盐转运蛋白由分子量为70～74 ku的单一肽链组成，并且所有植物中的硫酸盐转运蛋白与其他种类生物的硫酸盐转运蛋白有着高度的保守性和相似性，依据高亲和性和低亲和性一般划分为5个亚群。硫酸盐转运蛋白的主要功能是转运功能，是依赖于一个H+泵维持的膜间电势梯度的H+/SO42-共转运蛋白[21]。

17及20号蛋白为类似谷蛋白。谷蛋白是小麦面粉的主要蛋白成分，与小麦的粘性有关，占10%～15%左右。在草豆蔻中发现了谷蛋白说明其同为种子类植物，草豆蔻含有与小麦谷蛋白相似的蛋白，有待进一步深入对其开展提纯研究[22]。

18及40号蛋白为类似豆球蛋白。扁豆的类似豆球蛋白等电点在4.6左右，其包含约38 %的亲水氨基酸残基和40 %的疏水氨基酸残基。因此在pH值与其等电点相差较大的条件下，类似豆球蛋白可显示出良好的界面疏水性和可溶性，可将其应用于食品加工过程中，调节pH值5或7时可得到最佳的起泡效果，豆球蛋白的功能主要是凝胶性和乳化性[23]。从草豆蔻中检出的类似豆球蛋白等电点在5.89左右，分子量约为42 ku，说明其与扁豆有所差别，有待进一步研究。

22号蛋白属过氧化物酶体蛋白，存在于一切真核细胞内。植物过氧化物酶体呈现高度的组织专业化特点，可分为4种不同类型：无差别型植物过氧物酶体；富含脂肪酸氧化的乙醛酸循环酶及乙醛酸循环酶；存在于光合作用组织、涉及乙醇酸代谢的叶子过氧化物酶体；主管光呼吸及根结节的过氧化物酶体。其主要功能为：参与光呼吸作用，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢；在种子萌发的过程中进行脂肪酸的氧化，完成乙醛酸循环[24]。

24号蛋白为泛素蛋白连接酶E3，是真核生物体内最重要的蛋白降解所需酶类之一，具有高度选择性。E3能够特异性识别并结合目标蛋白，可分为环指结构域、U形箱式结构域、F形箱式结构域及HECT结构域共3种结构域蛋白家族，其通过形成不同结构域的复合体发挥生物功能，主要涉及细胞的分裂和分化、蛋白的磷酸化修饰、异常细胞的增殖和消除、抗病原体感染等[25]。

31号蛋白为小分子热休克蛋白。自然界所有的原核和真核生物都有热休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP），是一组具有重要生理功能、高度保守的蛋白质分子家族，生理、病理及环境因素等都可诱导热休克蛋白的产生。小分子热休克蛋白是植物在应对热休克反应时合成的一种重要的应激蛋白，有研究表明，通过测定植物花、果实或种子中HSP的表达可以证明植物在遭受水压、光、有机或无机物胁迫时也会合成这种小分子蛋白。热休克蛋白主要功能为：提高细胞对应激原的耐受性；维持细胞蛋白的结构功能；参与免疫调节等[26]。

从以上分析结果可知，有些差异蛋白具有不同的抗菌、提高免疫或抵御抗毒的作用，比如编号为11、12、13的蛋白为类似豌豆球蛋白抗菌肽，暗示霸王岭草豆蔻中的这几种蛋白可能具有一定的抗菌活性，需要进一步深入研究，本课题组后续研究的内容是应用生物信息学方法分析海南草豆蔻的全蛋白，系统地得到它们的蛋白网络图谱，并针对这几种抗菌肽蛋白设计试验，验证其药物活性。

3 结论

通过蛋白质组学方法，应用双向电泳提取分离了海南不同产地草豆蔻的蛋白，获得了40个从属于22种植物的差异显示蛋白，这些差异蛋白涉及草豆蔻的不同生物功能，主要表现在植物的应激反应、抗菌活性、细胞分裂增殖及对植物物理性状的影响等方面。结合草豆蔻极其主要的活性组份具有抗炎抑菌、毒性低等的特点，预测这些差异蛋白也可能具有一定的抗菌活性，包括11、12及13号的类似豌豆的抗菌肽段；7或25号的纤维状细胞分裂蛋白；24号的泛素蛋白连接酶E3；31号的小分子热休克蛋白；14及35号的谷胱甘肽s-转移酶。本研究结果获得了海南草豆蔻的蛋白信息，补充和完善了草豆蔻中所含物质的研究，从一定程度上反映了不同产地的草豆蔻的生物多样性特点，为进一步探索这种药食同源的植物提供了科学合理的理论指导。

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