八宝丹对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响

关建华 ，靳祎祎 ，庄群川 ，2，黄 彬 ，彭 军 ，2，魏丽慧 ，2，林久茂 ，2

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

血管生成在肿瘤发生等病理生理过程中起重要作用。肿瘤血管新生与肿瘤生长及迁移有着密不可分的联系［1］，新生的血管为肿瘤细胞的生长和转移提供氧气和营养，与肿瘤细胞增殖、转移呈正相关。若无血管系统提供氧气和养料，实体瘤的增长不会超过1 mm3，因此，抗血管生成是肿瘤治疗的主要策略。血管新生是个复杂的过程，主要涉及血管内皮细胞的增殖、迁移等过程［2］。名贵中成药八宝丹（Babao Dan，BBD）具有清热利湿、活血解毒、祛黄止痛等功效。相关研究显示BBD治疗肿瘤临床疗效显著，可明显减轻化疗药物对肝功能的损伤，与化疗合用可以减缓患者痛楚，改善临床症状，提高生活质量，减轻或延缓化疗药物引起的外周血象下降速度，降低感染的几率，延长临床生存期［3-4］。同时，研究结果表明八宝丹干预后的肿瘤细胞增殖能力降低，凋亡增加，细胞迁移数目减少［5］。但BBD抗肿瘤作用机制方面的研究尚不系统和深入，多停留在药效作用观察上。本文通过观察BBD对血管内皮细胞增殖和迁移的影响，探讨其抑制肿瘤血管新生的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞 人脐静脉内皮细胞（HUVEC），购于中南大学湘雅细胞中心。

1.2 实验药物 BBD（厦门中药厂股份有限公司，0.3 g／粒），使用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成 25 mg／mL的药液。

1.3 实验试剂 胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、RPMI 1640培养基（美国Life technologies公司）；青霉素-链霉素混合液（美国Thermo公司）；MTT粉末、结晶紫（北京索莱宝科技有限公司）。

1.4 实验仪器 超净工作台（苏州净化设备公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；DMIL LED倒置显微镜系统（德国Leica公司）；连续波长多功能酶标仪（奥地利TECAN公司）；Countes®全自动细胞计数仪（美国Life technologies公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 HUVEC采用RPMI 1640完全培养基（含 10%FBS、100 U／mL 青霉素、100 μg／mL 链霉素），置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

2.2 细胞活力分析 采用MTT法进行细胞活力分析。取对数生长期的HUVEC按1×104个／孔接种于96孔培养板中（100 μL／孔），培养细胞汇合度达到50%～60%时，将细胞分成对照组和实验组，吸弃培养液，对照组每孔加入不含BBD的培养液100 μL，实验组每孔加入含不同浓度 BBD（0.25、0.5、0.75 mg／mL）培养液 100 μL，培养 24 h 后每孔加入100 μL MTT（0.5 mg／mL）继续培养 4 h，吸弃液体后加入 DMSO 100 μL／孔，室温放置 10 min，充分振荡混匀后于酶标仪（波长570 nm）测吸光度（A）值。细胞活力与细胞生长抑制率计算公式如下。

细胞活力／%＝实验组A值／对照组A值×100%；

细胞生长抑制率／%＝（对照组A值－实验组A值）／对照组A值×100%。

2.3 观察细胞形态 取对数生长期的HUVEC按2×105个／孔接种于 6孔培养板中（2 mL／孔），培养细胞汇合度达到50%～60%时，细胞经不同浓度BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干预 24 h 后，使用倒置显微镜对细胞的形态变化进行观察并拍照。

2.4 划痕损伤修复实验 取对数生长期的HUVEC按6×105个／孔接种于6孔培养板中（2 mL／孔），当汇合度达到80%～90%时进行划痕，用20 μL无菌枪头装于移液器枪头处，握住移液器采用一定力度垂直于板底进行横线划痕，随后吸出原培养基，每孔加1 mL PBS清洗3遍，最后一次PBS保留不吸出，拍照即记为0 h，然后吸弃PBS，加入含不同浓度 BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）的完全培养液培养，分别干预12 h和24 h后随机取5个视野，倒置显微镜下观察拍照。

2.5 Transwell迁移分析 HUVEC经不同浓度BBD（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干预处理 24 h 后，吸弃含药培养基，消化离心收集细胞，用空白培养基重悬调整细胞密度为2.5×105个／mL，上室内加入200 μL 包含有 5×104个细胞，下室加入 700 μL 完全培养基，放入恒温箱培育12 h后吸弃培养基，用干棉棒轻轻擦拭小室内部，使用蘸有PBS的棉签轻轻擦拭小室内部（切记不要捅破小室）；4%多聚甲醛固定和结晶紫染色，PBS洗涤后于倒置显微镜镜下随机选取5个视野拍照。

2.6 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。

3 实验结果

3.1 BBD对HUVEC增殖的影响 见表1。

3.2 BBD对HUVEC形态的影响 倒置显微镜观察结果显示HUVEC经不同浓度BBD干预24 h后，BBD可减少HUVEC的细胞密度，并使部分细胞脱落，呈剂量依赖作用。见图1。

3.3 BBD对HUVEC划痕损伤修复的影响 划痕损伤修复实验结果显示BBD对HUVEC的划痕损伤修复具有明显的抑制作用，且具有明显的剂量依赖。见图2。

表1 BBD 对 HUVEC 增殖的影响（n＝8，x±s）

图1 BBD对HUVEC形态的影响（×200）

图2 BBD对HUVEC划痕损伤修复的影响（×100）

3.4 BBD对HUVEC迁移能力的影响 Transwell实验结果显示BBD对HUVEC的迁移能力有明显的抑制作用，随着BBD剂量增大，迁移的细胞逐渐减少，具有显著的量效作用。见图3。

4 讨 论

图3 BBD对HUVEC迁移能力的影响（×100）

肿瘤生长及其转移灶形成的最根本原因是依赖于血管的形成［6］。血管新生在实体肿瘤的生长、恶变以及转移等方面至关重要［7］，是一个复杂的、受高度调控的生理过程［8］，其中血管内皮细胞向肿瘤移行是一个重要环节，内皮细胞通过增殖、游走、黏附到相应部位构成血管样结构，这表明抗血管生成治疗在抑制肿瘤进展方面是有效的［9］。因此，针对抑制血管内皮细胞的增殖、迁移，使肿瘤血管生成得到抑制，从而切断肿瘤细胞的营养来源，抑制其生长与转移。

BBD起源于明代，距今已有四百多年的临床应用历史，主要由牛黄、三七、羚羊角、蛇胆、珍珠、麝香等药物组成，具有清利湿热、活血解毒、去黄止痛之功效［10］，其临床应用于治疗传染性病毒性肝炎、急性胆囊炎、急性泌尿系感染等。近年来，围绕其清热利湿、活血止痛、抗炎解毒的功能，现代医学专家不断探讨与实践，该方应用范围逐渐扩大，在恶性肿瘤、自身免疫性疾病以及其他疑难杂症的治疗方面也取得了良好的效果［3-5，11］。

在本研究中，我们以HUVEC为研究对象，用不同浓度BBD进行干预，观察其对HUVEC的增殖和迁移的影响，MTT检测结果显示不同浓度的BBD可显著抑制HUVEC的增殖，具有一定的剂量依赖性。血管内皮细胞迁移是血管新生的重要驱动因素，划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，体外观察细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力［12］。在本实验中，BBD对HUVEC的划痕损伤修复具有明显的抑制作用，呈现明显的剂量依赖作用，提示BBD可抑制HUVEC细胞的迁移能力。此外，血管内皮细胞穿透基底膜脱离原部位是发生血管新生的另一关键环节。Transwell是通过计算相同时间内穿过小孔膜的细胞数来反映细胞迁移能力，穿过小孔膜的细胞数越多，迁移能力越强［12］。Transwell实验结果表明，对照组有较多的细胞穿过小孔膜，BBD干预后穿过小孔的细胞数量逐渐减少，说明BBD能显著降低HUVEC的迁移能力。

综上可见，BBD可通过抑制血管内皮细胞增殖及迁移来发挥抑制血管新生的作用，为此提示BBD治疗肿瘤的作用机制可能与其抑制肿瘤血管新生有关。但血管新生是个复杂的过程，涉及多个因素、多个环节、多种细胞因子、多条信号通路等协同调控的多步骤过程，因此有关BBD抑制血管新生的分子作用机制有待进一步阐明。

［1］ 尹逊天，王巍，朱玉峰，等.枸杞多糖对人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移及血管形成的影响［J］.中国老年学杂志，2016，36（8）：1819-1822.

［2］ 徐小兵，郭美霞，金鑫鑫，等.塞来昔布抑制血管内皮细胞迁移的实验研究［J］.医学研究生学报，2017，30（6）：601-605.

［3］ 耿冬梅，张良明，隋铭骅.八宝丹胶囊辅助晚期肿瘤化疗的研究［J］.山西医药杂志，2010，39（6）：562-564.

［4］ 朱宪军，张学德.八宝丹防治肿瘤化疗毒副作用的临床观察［J］.中国民间疗法，2006，14（5）：45-46.

［5］ 成瑜，李洪伦.八宝丹处理肺腺癌细胞A549和SPCA-1对顺铂化疗敏感性的影响［J］. 滨州医学院学报，2016，39（6）：414-417.

［6］ 林薇，赵锦燕，郑良朴，等.片仔癀对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响［J］.福建中医药大学学报，2011，21（1）：25-27.

［7］ 向昕，刘志伟，顾万清，等.TACE后肝癌微血管密度及VEGF表达与再手术治疗［J］.肝胆外科杂志，2004，12（1）：24-26.

［8］ LIN J，WEI L，XU W，et al.Effect of Hedyotis Diffusa Willd extract on tumor angiogenesis ［J］.Mol Med Rep，2011，4（6）：1283-1288.

［9］ LIN J，WEI L，SHEN A，et al.Hedyotis diffusa Willd extract suppresses Sonic hedgehog signaling leading to the inhibition of colorectal cancer angiogenesis ［J］.Int J Oncol，2013，42（2）：651-656.

［10］沈美蓉，裴彬，李仲平.八宝丹胶囊治疗黄疸型病毒性肝炎临床研究［J］.河北中医，2012，34（4）：492-494.

［11］ 柯樱，赵亚红.八宝丹的临床应用研究进展［J］.中成药，2017，39（2）：386-389.

［12］冯健愉.从VEGF-C调控淋巴管新生研究片仔癀抑制大肠癌转移的作用机制［D］.福州：福建中医药大学，2016.