复方熊胆茵陈颗粒对非酒精性脂肪性肝炎大鼠TNF-α的影响

伍 娟 ，赵锦燕 ，洪振丰 ，李 煌

（1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建 福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；4.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

复方熊胆茵陈颗粒（批准文号：闽药制Z201100 07）是福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂，获得国家知识产权局的授权专利（ZL201210516 947.9）。方中含有熊胆粉、茵陈、山楂、泽泻、白术及柴胡等中药，具有清肝利湿、疏肝健脾的功效。课题组前期临床研究表明复方熊胆茵陈颗粒治疗非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）疗效显著，能明显改善模型大鼠的肝脏脂肪变性和脂滴聚集情况，具有降血脂及治疗脂肪肝的作用［1-4］。本研究旨在观察复方熊胆茵陈颗粒对NASH大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）表达的影响，以进一步探讨复方熊胆茵陈颗粒治疗NASH的作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物 SD大鼠60只，雄性，体质量（180±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪 2017-0005），批号：200700053 1494。

1.2 实验药物 复方熊胆茵陈颗粒的主要组成药物购于福建中医药大学国医堂，采用水提醇沉法制备浸膏，加入辅料制得复方熊胆茵陈颗粒，每克相当于生药1.314 g；西利宾安购自江苏中兴药业有限公司。

1.3 实验试剂 通用RT-PCR试剂盒（中国宝生物工程有限公司）；目的基因引物DNA（上海捷瑞生物工程有限公司合成）；TNF-α免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.4 实验仪器 APC 300电泳仪（美国Bio-Rad公司）；9600 PCR仪（美国PE公司）；水平电泳槽（美国BioRad公司）；DU-650蛋白核酸分析仪（美国Beckman公司）；凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）等。

2 实验方法

2.1 动物造模、分组及给药 将60只雄性SD大鼠随机分为6组，每组10只。空白组大鼠喂食基础饲料，饮用清洁水；其余各组大鼠喂食高脂饲料（含10%猪油，90%基础饲料）6周，每周1次后肢皮下注射40%CCL4花生油溶液（按照首次剂量5 mg／kg，以后3 mg／kg）制备非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。造模成功后西利宾安组按0.02 g／（kg·d）予西利宾安灌胃，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按4.73、9.46、18.92 g／（kg·d）予复方熊胆茵陈颗粒灌胃，空白组和模型组予等量生理盐水灌胃，灌胃给药期间继续予以高脂饲料喂养。各组大鼠均在每天上午9～11时进行灌胃，1次／d，连续4周。

2.2 取材 灌胃干预4周后取材，取材前一晚禁食，取材当天称重后予3%戊巴比妥钠以60 mg／kg腹腔注射麻醉，摘取肝右叶肝组织1 cm×1 cm×1 cm，用4%多聚甲醛固定，用于形态学检测；再取肝左叶0.5～1 g肝组织放入液氮罐中，-80℃冰箱保存，用于PCR检测及免疫组织化学分析。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 HE染色 取肝右中央叶用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备石蜡切片（厚度为4 μm），用苏木素—伊红染色，光学显微镜下观察肝组织的病理改变。

2.3.2 肝组织TNF-α mRNA表达 采用RT-PCR法检测肝组织中TNF-α mRNA表达。Trizol法提取肝组织总RNA，取1 μg总RNA进行逆转录反应，得到cDNA进行PCR扩增，采用Primer 5.0软件设计 TNF-α 的引物，TNF-α：primer F GATCTCAAAG ACAACCAACTG，primer R CTGGTATGAAATGCAAA TCG；GAPDH：primer F ACAGCAACAGGGTGGTGGA C，primer R TTTGAGGGTGCAGCGAACTT。 采 用20 μL 体系，反应条件：94 ℃变性 5 min；94 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环；72 ℃终末延伸10 min，得到PCR产物，琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像系统分析。

2.3.3 肝组织TNF-α蛋白表达 免疫组织化学法检测肝组织中TNF-α的蛋白表达，应用MoticMed 6.0图像分析系统分析TNF-α免疫组织化学染色切片，以胞浆和胞膜呈棕黄色颗粒作为阳性表达的判断标准，染色结果用灰度值进行半定量分析。

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料符合正态分布以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。

3 结 果

3.1 各组大鼠肝脏组织病理学分析 镜下可见：① 空白组大鼠肝细胞排列整齐，形态正常，呈多边形，细胞核位置居中。模型组大多数肝细胞发生脂肪变性，视野中满布大量脂肪空泡，范围超过2／3，肝小叶边界模糊，肝索结构紊乱，伴有炎细胞浸润，属病理+++级。②西利宾安组镜下少量脂肪空泡，范围小于1／3，伴有少量炎细胞浸润，属于轻度脂肪肝，符合病理+级。③ 低剂量组视野中有1／3～1／2细胞发生脂肪变性，汇管区伴有少量炎细胞浸润，属于中度脂肪肝，介于病理+～++级。④ 中剂量组视野中偶见脂肪空泡，受累细胞范围约1／3，符合病理+级。⑤ 高剂量组肝小叶完整，肝细胞呈条索状排列，视野中只有极少数脂肪空泡，累及肝细胞不足1／3，未达到病理+级。复方熊胆茵陈颗粒各剂量组较模型组均有明显地减轻和好转。见图1。

图1 各组大鼠肝组织HE染色病理图（×40）

3.2 各组大鼠肝组织TNF-α mRNA表达比较见图 2、表 1。

图2 各组大鼠肝组织中TNF-α mRNA凝胶电泳图

3.3 各组大鼠肝组织TNF-α蛋白表达比较 见图 3、表 1。

4 讨 论

图3 各组大鼠肝组织TNF-α免疫组化图（×40）

表1 各组大鼠肝组织TNF-α mRNA及蛋白表达比较（x±s）

非酒精性脂肪性肝炎以肝实质细胞脂肪样变性，同时伴有炎症反应、组织学改变和持续的肝损伤为主要特征，NASH可进一步发展为肝纤维化、肝硬化，对NASH的防治是阻止非酒精性脂肪性肝病持续发展的关键［5］。大多数NASH的病理进程都伴随着炎症反应的发生，这说明炎症反应和NASH的发病密切相关［6-9］，通过调控炎症因子的表达可以达到控制和治疗NASH的目的。在炎症发生过程中，肝脏的固有免疫细胞被激活，释放出大量的促炎因子TNF-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6等，炎症因子之间互相促进，产生所谓的炎症级联反应，进而导致炎症反应失控，进一步加重肝细胞损伤。TNF-α是一种具有多重效应的炎症因子，可通过诱导脂类和多肽介质的产生诱发肝细胞脂质过氧化，激活中性粒细胞，促进肝细胞凋亡等途径引起肝细胞损伤。肝脏中有着丰富的TNF-α受体，TNF-α可直接作用于肝组织引起肝损伤，通过抑制TNF-α则可减少肝细胞的凋亡和坏死［10］。多研究表明下调TNF-α的表达，能减轻肝脏病理学损伤程度，其机制可能与阻止肝脏炎症反应有关［11-14］。

西利宾安为临床常用护肝药，疗效确切，因此本研究用西利宾安作为阳性对照。本实验中HE染色显示模型组肝细胞发生明显脂肪变性，视野中满布大量脂肪空泡，肝索结构紊乱，伴有炎细胞浸润，肝脏TNF-α mRNA及蛋白的表达较空白组均明显升高（P＜0.05），说明模型组大鼠肝脏发生炎症反应，肝细胞损伤。通过4周复方熊胆茵陈颗粒的治疗，HE染色显示复方熊胆茵陈颗粒各剂量组肝细胞脂肪空泡明显减少，肝脂肪变性及炎症损伤明显好转；RT-PCR和免疫组化结果显示，复方熊胆茵陈颗粒各剂量组肝脏TNF-α mRNA及蛋白的表达较模型组均明显降低（P＜0.05），复方熊胆茵陈颗粒各组降低TNF-α的作用呈量效关系。提示复方熊胆茵陈颗粒能减轻NASH大鼠肝脏炎症反应，保护肝细胞，通过调控炎症反应为其治疗NASH的机制之一。

综上所述，复方熊胆茵陈颗粒通过降低TNF-α的表达，减少大鼠肝脏炎症反应的发生，减少肝细胞损伤。以上结果说明调控炎症反应是复方熊胆茵陈颗粒治疗NASH的作用机制之一。但NASH发病原因复杂，因此仍需进一步研究来阐明其作用机理。

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