枣果黑斑病对南疆红枣品质的影响

许 瑛，姚兆群，王 兰，赵思峰

(1.新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学 农学院，新疆石河子 832003；2.塔里木大学 植物科学学院，新疆阿拉尔 843300 )

红枣(ZizyphusjujubeMill)富含维生素、氨基酸、糖类、蛋白质等多种营养成分，是集营养保健与医药疗效为一体的优质果品[1]。新疆南疆已成为中国重要的商品枣基地，红枣种植对当地农民增收发挥重要作用[2]。近年来枣果黑斑病在南疆红枣种植区普遍发生，轻者发病率达到10%左右，严重地块甚至60%以上的果实发病，发病病果表面出现黑色斑块，病组织深入果肉3～5 mm，易脱落，对红枣产量和品质均造成较大影响[3-4]。消费者通常依据红枣果品的大小、色泽、风味、营养、质地等特征来评价红枣品质的优劣，已有报道表明产地和年份对红枣品质有较大影响[5]，而合理密植、合理的水肥管理[6-8]、合理修剪及适期采收[9-10]等措施均可有效提高枣果内在及外观品质。目前，对新疆枣果黑斑病的研究已有很多，主要集中在危害情况、病原鉴定、发生规律调查以及防治方法等方面[3-4]，而红枣感染黑斑病后的品质变化和食用安全性方面的研究则未见报道。枣果黑斑病的致病菌主要为链格孢菌(Alternariaalternata)[3-4]，已有大量文献报道该菌可产生交链孢酚(Alternariol，AOH)、交链孢酚单甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)、交链孢烯(Altenuene，ALT)、交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid，TeA)、AAL毒素(Alternariaalternatatoxin，AAL)、交链孢毒素(Altertoxin，ATXs)和腾毒素(Tentoxin，TEN)等70多种真菌毒素，其中AOH和AME对哺乳动物具有强致癌性，且存在协同效应[11-13]，而TeA已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)列入有毒化学物质，作为必须检测对象[14]。2015年中国针对出口水果制订链格孢菌毒素检测标准，但对红枣枣果感染链格孢菌后毒素检测办法和标准目前尚未见报道[15]。

本研究以南疆产量较大的‘骏枣’和‘灰枣’2个品种为研究对象，通过对健康枣果和被链格孢菌感染不同发病程度枣果的外观、着色、营养价值、风味等内外品质指标进行比较，同时对不同发病程度果实中链格孢菌毒素种类及数量进行测定，最终评价枣果黑斑病对南疆红枣品质和食用安全性的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

枣果：2016年在新疆阿拉尔市农科所实验枣园采集，枣园树龄6 a，老枣股结果，栽培密度为0.6 m×1.5 m，灌水方式为滴灌，常规管理，采集品种有‘骏枣’和‘灰枣’。在果实脆熟期，分别从不同品种枣园随机选取树冠外侧2～3 a生枣股上健康和感病果实样品，将采集的红枣在低温冷藏条件下带回实验室，备用。采集回来的‘骏枣’‘灰枣’枣果参考刘艳祥等[16]报道黑斑病病害分级标准并略作修改后分级。0级：果面光洁，无病斑；1级：果面病变面积占总面积20%以下；2级：果面病变面积占总面积21%～40%；3级：果面病变面积占总面积41%～60%；4级：果面病变面积占总面积61%以上。各等级枣果随机混匀用于后续各种指标的测定。

试剂：交链格孢酚单甲醚(AME)和链格孢酚(AOH)标准品购于美国Sigma公司；细交链格孢菌酮酸(TeA)和交链孢烯(ALT)标准品购于北京莱耀生物公司；L-亮氨酸、蒽酮、乙酸乙酯、茚三酮、抗坏血酸、乙酸乙酯、3,5-二硝基水杨酸、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白质、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、乙腈等试剂购于石河子市沃德生物试剂营销部。Xevo TQ/MS超高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司)，配有AcquityUPLCBEH C18液相色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)。

1.2 方 法

1.2.1 外在品质测定 分别随机选取20 颗不同病级的‘骏枣’和‘灰枣’枣果，用电子天平称量单果质量、数显电子游标卡尺测定果实纵经、横经并计算其果形指数；使用GY4硬度计测定果肉硬度，每个果实去皮后随机测定5次，取平均值；果皮色差使用色彩色差仪自动检测，采用“CIE Lab”表色系统，在D65/10光源下测定L*(亮度)，a*(红色饱和度)和b*(黄色饱和度)，根据测定结果分别计算其色泽比(CIE)、色饱和度、色差(NBS)，每个果实测定4个果面及果实胴部，共计测定5个面；将20个果实烘干至恒量计算质量含水量。

1.2.2 内在品质测定 分别随机选取20 个黑斑病不同病级的‘骏枣’和‘灰枣’枣果，将单个红枣去皮去核，果肉用混合冷冻球磨仪打碎，分别测定维生素C、蛋白质、游离氨基酸、可溶性糖、还原糖、可滴定酸的含量，每个样品重复3次。其中维生素C采用紫外快速测定法[17]，蛋白质采用考马斯亮蓝G-205染色法，可溶性总糖采用蒽酮比色法，还原糖采用3,5二硝基水杨酸法，游离氨基酸采用茚三酮比色法[18-19]，可滴定酸采用酸碱滴定法测定[20]。

1.2.3 不同发病程度枣果中链格孢菌毒素检测 毒素提取：分别称取上述各等级破碎果肉2 g，加入50 mL离心管中，加入φ=1%甲酸-乙腈溶液10 mL、冷水10 mL，旋涡震荡10 min，继续加4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠震荡10 min，5 000 r/min 离心5 min，轻轻吸取4 mL上清液与15 mL离心管中，加入0.2 g PSA、0.6 g无水硫酸镁震荡提取30 min，4 000 r/min离心5 min，轻取2.5 mL上清液使用水浴氮吹仪浓缩干燥，之后使用0.2 mL甲醇溶解，过滤，取该提取液到超高效液相色谱-串联质谱仪用于链格孢霉毒素检测。

毒素检测条件：超高效液相色谱-串联质谱条件色谱柱：Acquity UPLC BEH C18液相色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈-水(φ=0.1%甲酸)；离子化模式：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压3.5 kV，锥孔电压40 kV，离子源温度150 ℃，雾化温度500 ℃，脱溶剂气流量1 000 L/h，锥孔气流速50 L/h。4种链格孢霉毒素的监测离子、锥孔电压和碰撞电压等质谱参数见表1。

1.3 数据处理

测定得到的数据采用Excel 2010处理，用SPSS 19.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同发病严重度对果实外观品质的影响

2.1.1 对物理性状的影响 与健康枣果相比，‘骏枣’和‘灰枣’不同发病程度枣果大小、果形指数、硬度、质量含水量均存在显著性变化(表2)。与健康‘骏枣’相比，随着发病严重度的增加，骏枣单果质量下降幅度为5.33%～45.61%；果实横经降低5.2%～13.4%，纵经间无显著差异；果形指数增加1.39%～12.5%；硬度降低11.4%～56.0%；质量含水量降低1.43%～18.1%。与健康‘灰枣’相比，发病‘灰枣’鲜果质量略有增加，增加幅度为7.5%～20.0%；果实纵径增加0.08%～15.40%，横经无显著变化；果形指数增加4.17%～10.42%；硬度下降13.88%～39.04%；质量含水量间也存在显著差异，发病越严重质量含水量越低，1～4级灰枣分别减少11.05%～23.15%。

2.1.2 对果实色度的影响 红枣感染枣果黑斑病后枣果色度也发生明显变化(表3)。其中L*表示果皮色泽的明暗程度，L*越大，果实越亮，a*表示红色与绿色相比的程度，a*值越大，果实红色越深，b*表示黄色与蓝色的相比程度，b*值越大，果实黄色越深，色泽比h是色调参数中的1个指标，当h>1说明果实偏红偏暗，色饱和度C表示色彩的纯洁性，C值越大，表示果实颜色越鲜艳，△Eab是L*、a*、b*综合比较的体现，直观的反应果实颜色差异。健康骏枣相比，发病骏枣L*值降低0.27%～15.13%；除1级病枣果a*值略有增加外，2级、3级、4级枣果a*值下降12.07%～32.91%；b*值下降2.26%～49.71%；色泽比h增加6.52%～45.65%；色饱和度C降低0.20%～34.06%；色差值降低0.19%～20.47%。与健康灰枣相比，发病灰枣L*值降低2.57%～12.74%；a*值除1级病枣果略有增加外，2级、3级、4级枣果a*值下降4.06%～8.28%；b*值下降5.79%～40.89%；色泽比h增加10.89%～63.28%；色饱和度C下降0.53%～18.29%；色差值降低1.43%～14.27%。

2.2 对果实内在品质的影响

红枣感染枣果黑斑病以后，红枣营养品质及口感等相关品质均会发生明显改变(表4)。与健康‘骏枣’相比，发病‘骏枣’维生素C质量分数降低29.61%～75.99%；可溶性蛋白质质量分数增加4.05%～84.39%；游离氨基酸增加11.02%～85.040%；1～3级病果可溶性糖含量分别增加8.47%～20.34%，但4级降低33.19%；1～3级病果还原糖含量增加9.35%～27.94%，但4 级降低30.57%；可滴定酸含量降低8.77%～15.79%；1～3级病果糖酸比增加20.91%～44.21%，4级病果下降22.71%。与健康‘灰枣’相比，1～3级发病‘灰枣’中维生素C质量分数分别降低21.77%～86.31%，4级病枣果中则未检测到维生素C；发病‘灰枣’中可溶性蛋白质质量分数增加2.77%～62.21%；游离氨基酸质量分数增加7.90%～76.32%；1～3级病果可溶性糖质量分数分别增加1.76%～16.19%，但4级降低26.91%；1～3级病果还原糖质量分数增加2.63%～33.68%，但4级降低3.62%；可滴定酸质量分数降低0%～18.52%；1～3级病果糖酸比增加5.39%～41.63%，4级病果下降24.21%。

表1 4种链格孢霉毒素的串联质谱测定参数Table 1 MS/MS parameters for 4 Alternaria mycotoxins

表2 不同发病严重度枣果物理性状比较Table 2 Comparison of different levels of physical propertie in Jujube fruits

2.3 不同发病程度枣果中毒素的检测

枣果黑斑病发病后在病枣果中可以检测到TeA、AME和AOH 3种链格孢菌产生的毒素，没有检测到ALT毒素(表5)。在检测出的3种

表3 不同发病严重度枣果色度比较Table 3 Comparison of different levels of chroma in jujube fruits

表4 不同发病严重度枣果内在品质比较Table 4 Comparison of different levels of internal quality in jujube fruits

表5 不同发病严重度枣果毒素种类及数量Table 5 The type and amount of mycotoxins in different disease severity jujube fruit

毒素中，TeA毒素的检出率最高且检出量也最大，在发病级数为1～4级的‘骏枣’中，TeA毒素检出量分别为6.72～217.42 mg/kg，‘灰枣’为28.58～135.40 mg/kg，在1份健康‘灰枣’检测到TeA，可能是样品污染所致；AOH毒素检出率次之，其在发病‘骏枣’的检出量分别为0.04～0.28 mg/kg，在发病‘灰枣’的检出量为0.62～2.24 mg/kg；AME毒素在发病‘骏枣’中的检出量为0.73～3.81 mg/kg，在‘灰枣’中的检出量为0.68～3.06 mg/kg。3种毒素总体上呈现出随着发病严重度的增加，对人体有害的链格孢菌毒素含量越来越高。

3 讨 论

‘骏枣’和‘灰枣’作为南疆主栽品种，其具有风味独特、营养价值高等优点，深受消费者喜爱。而黑斑病近年来发生日益严重，枣果感染黑斑病之后严重影响产量和品质。本研究通过对不同发病级数的‘骏枣’和‘灰枣’果实外观品质、内在品质、毒素种类及数量等指标进行测定分析。研究表明：发病‘骏枣’鲜果质量、硬度和质量含水量均降低，但果形指数增加；发病灰枣鲜果质量、果形指数增加，硬度和质量含水量降低。2种枣果发病后果皮L*(亮度)、C(色饱和度)和△Eab(色差)等指标均显著降低，果实偏红暗色。光照可以提高果皮的色度[21]，赵晓梅等[22]研究库尔勒香梨萼端黑斑病对其品质的影响，发现同一地区感病梨L 值小于健康梨，果实硬度降低。

2种枣果发病后维生素C质量分数显著降低，在4级‘灰枣’中未检测到维生素C。可溶性蛋白质和游离氨基酸质量分数显著加，其中2级枣果增加最多，可溶性蛋白质‘骏枣’增加84.4%，‘灰枣’增加62.2%，游离氨基酸‘骏枣’增加85% ‘灰枣’增加76.3%。病枣中可溶性糖和还原糖的质量分数存在显著差异，‘骏枣’中1～3级显著增加，4级显著降低，‘灰枣’中1～2级显著增加，4级显著降低。病枣中可滴定酸含量降低，‘骏枣’糖酸比为：2级>1级>3级>0级>4级，‘灰枣’为：2级>1级>3级>0级>4级。糖酸比是风味指标的综合体现，健康枣果小于病枣，可能与枣果成熟程度和采样存在误差有关。

在2种发病枣果中检测到3种毒素，分别为TeA、AME、AOH，未检测到ALE。在健康‘骏枣’中检测到TeA，‘灰枣’中未检测到毒素。陈月萌等[23]研究表明，链格孢霉毒素在有霉变的水果中存在较为普遍，在有霉变的苹果中检测到AOH和AME，在桃中检测到ALT和AOH，但在新鲜苹果、桃、梨中均未检出链格孢毒素。而本试验在1份健康枣果样品中检测到TeA，可能与采样误差或链格孢菌潜伏侵染产生毒素有关，其具体原因需要进一步研究确定。蒋黎艳等[24]研究表明，柑橘感染链格孢菌后各部位产生毒素含量会从发病部位扩散到健康部位累积，这与本试验结果相一致，枣果发病越严重毒素含量越高，但病斑面积达到61%以上(4级病枣)毒素含量相对减少，这可能与毒素代谢有关。本试验在病枣中检测到TeA最大达217.42 mg/kg，AME为 3.81 mg/kg，AOH为 2.24 mg/kg，而Smith等[25]研究也发现，小鼠静脉注射TeA钠盐时半致死剂量(LD50)为115～162 mg/kg。目前，暂未有枣果中链格孢毒素的检测标准及含量限定，所以在鲜枣加工、采后干制储藏等风险评估中应引起关注和重视。

4 结 论

本研究结果表明：与健康枣果相比，感病红枣果实外形、硬度、质量含水量等物理品质均有不同程度的下降，枣果色度、色饱和度等外观形态品质下降，与此同时枣果中的维生素C质量分数显著降低，因链格孢菌代谢或病菌侵入后促进枣果加速老熟，导致游离氨基酸、可溶性糖、还原糖含量、糖酸比等指标显著增加。在发病的‘灰枣’、‘骏枣’中均中检测到TeA、AME和AOH 3种毒素。综上所述，枣果黑斑病不仅仅造成减产，还可严重影响红枣的外观和内在果实品质，其致病菌链格孢菌产生的毒素对人体健康也有较大危害。为了减少黑斑病对红枣产业的危害，增加果农的经济效益，在生产上应该加强栽培管理和及时防治，减少该病害进一步扩展，同时在红枣采收时应严格把住质量关，对发生黑斑病的枣果，要及时筛除掉，不能用于进一步的加工和销售。

参考文献Reference：

[1] FANG S Z,WANG Z F,HU X S,etal.Hot-air drying of whole fruit Chinese jujube(ZizyphusjujubaMiller): physicochemical properties of dried products[J].InternationalJournalofFoodScience&Technology,2009,44(7):1415-1421.

[2] JIN X W,YAO X D,LIU C L,etal.Current development situations ofZiziphusjujubaindustry in south Xinjiang and recommendations[J].AsianAgriculturalResearch,2015(4):37-41.

[3] 董 宁,冯宏祖,王 兰,等.南疆骏枣黑斑病症状表现及病原菌鉴定[J].植物保护学报,2016,43(6):922-927.

DONG N,FENG H Z,WANG L,etal.The disease symptom and the pathogen identification of jujube black spot in southern Xinjiang [J].JournalofPlantProtection,2016,43(6):922-927.

[4] 孙红艳,热沙来提·买买提,刘多红,等.新疆红枣主要病害及综合防治技术[J].北方园艺,2011(13):148-149.

SUN H Y,RESHALAITI·M,LIU D H,etal.Main diseases of jujube and integrated control technology in Xinjiang [J].NorthernHorticulture,2011(13):148-149.

7.2.12根腐病①加强管理，保持树体生长健壮。多施有机肥，病树可施入赛众28微肥2～3公斤，使土壤透气性良好，根系在生长良好的条件下抗病力强。尽量不用山洪等污水灌溉。②加强早期落叶病、腐烂病的防治，避免引起树体衰弱，诱发根腐病。③对发病树及周围可被侵染的植株，用甲基硫菌灵800倍，硫酸铜300～400倍液灌根。连片发病时有必要挖深60厘米、宽20～30厘米的隔离沟，防止传播蔓延。

[5] 马庆华,续九如,姚立新,等.不同产地‘冬枣’果实品质差异的研究[J].河北农业大学学报,2007,30(2):57-60.

MA Q H,XU J R,YAO L X,etal.Studies on the quality difference of ‘Dongzao’ jujube from different sources [J].JournalofAgriculturalUniversityofHebei,2007,30(2):57-60.

[6] 唐 都,高疆生,徐崇志,等.阿拉尔垦区不同种植密度下骏枣果实品质的比较[J].新疆农业科学,2012,49(12):2208-2212.

TANG D,GAO J SH,XU CH ZH,etal.The comparison of fruit appearance chroma of jujube under different cultivation densities in Alar reclamation area[J].XinjiangAgriculturalSciences,2012,49(12):2208-2212.

[7] 徐 镕,孙三民,王立洪.间接地下滴灌下灌水量对枣树生理特征及果实品质的影响[J].中国农村水利水电,2014(1):50-53.

XU R,SUN S M,WANG L H.The effect of irrigation amount on physiological characteristics and quality of jujube under indirect subsurface drips[J].ChinaRuralWaterandHydropower,2014(1):50-53.

[8] 冯宏祖,支金虎,蒋先龙,等.不同微肥追肥模式下红枣产量和品质的效应分析[J].新疆农业科学,2011,48(12):2240-2244.

FENG H Z,ZHI J H,JIANG X L,etal.Effects analysis of Chinese dates yield and quality under different spraying mode of trace element fertilizers[J].XinjiangAgriculturalSciences,2011,48(12):2240-2244.

[9] 王学军.提高金丝小枣果实品质的措施[J].河北果树,1995(3):19-20.

WANG X J.Measures to improve the golden silk jujube fruit quality[J].HebeiFruits,1995(3):19-20.

[10] 王 德,高疆生,吴翠云,等.不同坐果期枣果实品质差异的研究[J].新疆农业科学,2016,53(2):254-260.

WANG D,GAO J SH,WU C Y,etal.Studies on the quality difference of jujube during different bearing periods [J].XinjiangAgriculturalSciences,2016,53(2):254-260.

[11] ADOUGLAS K,JOHNE S.Alternariatoxins and their importance in food[J].JournalofFoodProtection,1984,47(11):886-901.

[12] 闫 璐,高贵田,哈益明,等.谷物中链格孢毒素的研究进展[J].核农学报,2017,31(2):334-341.

YAN L,GAO G T,HA Y M,etal.Research progress ofAlternariain grain [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2017,31(2):334-341.

[13] PFEIFFER E,ESCHBACH S,METZLER M.Alternariatoxins: DNA strand-breaking activity in mammalian cells in vitro[J].MycotoxinResearch,2007,23(3):152.

[14] OSTRY V.Alternariamycotoxins: an overview of chemical characterization,producers,toxicity,analysis and occurrence in food stuffs[J].WorldMycotoxinJournal,2008,1(2):175-188.

[15] 李建华,何 强,孔祥虹,等.SN/T4259-2015.出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定 液相色谱—质谱/质谱法[S].北京:中国标准出版社,2015:1-21.

[16] 刘艳祥,郭庆元,王登元,等.新疆红枣黑斑病防治药剂筛选[J].河南农业科学,2016,45(9):78-83.

LIU Y X,GUO Q Y,WANG D Y,etal.Screening of fungicides for controlling jujube fruit black spot in Xinjiang[J].JournalofHenanAgriculturalSciences,2016,45(9):78-83.

[17] 张 琦.果树栽培学实验实习指导书[M].北京:中国水利水电出版社,2013.

ZHANG Q.Fruit Tree Cultivation Experimental Practice Guide Book[M].Beijing:China Water&Power Press,2013.

[18] 高俊凤.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社,2006.

GAO J F.Plant Physiology Experiment Guidance [M].Beijing: Higher Education Press,2006.

[19] 曹建康,姜微波.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京：中国轻工业出版社,2007.

CAO J K,JIANG W B.Guidance on Postharvest Physiology and Biochemistry of Fruits and Vegetables[M].Beijing:China Light Industry Press,2007.

[20] 龚玲绨,徐清渠.GB/T 12346-2008.食品中总酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

GONG L T,XU Q Q.GB/T 12346-1990.Method for Determination of Total Acid in Foods[S].Beijing:Standards Press of China,2008.

[21] 杨 伟,刘秀印,唐 都,等.阿拉尔垦区不同栽培密度下骏枣果实外观色度的比较[J].新疆农业科学,2012,49(7):1203-1206.

YANG W,LIU X Y,TANG D,etal.The comparison of fruit appearance chroma of jujube under different cultivation densities in Alar reclamation area[J].XinjiangAgriculturalSciences,2012,49(7):1203-1206.

[22] 赵晓梅,吴玉鹏,马合苏提·卡力甫别克,等.不同产地库尔勒香梨萼端黑斑病对果实品质的影响[J].安徽农业学,2016,44(22):77-79,127.

ZHAO X M,WU Y P,MAHESUTI·K,etal.Effects of calyx end black spot of Korla fragrant pear from different producing aeas on fruit quality[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences,2016,44(22):77-79,127.

[23] 陈月萌,李建华,张 静,等.高效液相色谱—荧光检测法同时测定水果中的3种链格孢霉毒素[J].分析试验室,2012,31(6):70-73.

CHEN Y M,LI J H,ZHANG J,etal.HPLC-FLD of 3Alternariamycotoxins were all detected in fruits[J].ChineseJournalofAnalysisLaboratory,2012,31(6):70-73.

[24] 蒋黎艳,龚 蕾,盖智星,等.人工接种温州蜜柑后链格孢霉毒素的产生及分布规律[J].食品科学,2016(6):1-10.

JIANG L Y,GONG L,GAI ZH X,etal.Distribution ofAlternariamycotoxins pollution in satsuma orange(Citrusunshiu) during inoculated [J].FoodScience,2016(6):1-10.

[25] SMITH E R,FREDRICKSON T N,HADIDIAN Z.Toxic effects of the sodium and the N,N′-dibenzylethylenediamine salts of tenuazonic acid(NSC-525816 and NSC-82260)[J].CancerChemotherapyReports,1968,52(5):579-585.