硬粒小麦与野生二粒小麦籽粒铁、锌、硒元素质量分数的相关性分析

姬虎太，王 敏，曹 勇，李晓丽，姜兰芳，马小飞

(山西省农业科学院 小麦研究所，山西临汾 041000)

铁、锌等微量元素缺乏症，即隐性饥饿，是全世界所面临的首要营养不良问题，该问题在亚非拉等发展中国家尤其突出[1]。据世界卫生组织研究,当前全世界约有40亿人口正遭受着隐性饥饿的威胁(WHO，2014)，隐形饥饿已成为全世界普遍存在和广泛关注的重要问题。在中国，隐形饥饿同样也是一个重大的社会公共健康问题，在陕、甘、宁、新等西北地区微量元素缺乏问题尤为严重。大量研究指出，增加口粮中铁、锌等的摄入量是解决隐形饥饿问题最安全、最经济和最有效的途径[2-5]。

小麦(TriticumaestivumL.)是世界上消费量最大的粮食作物之一，提供全球约30%的谷物消费量[6]。作为中国第二大粮食作物，小麦是中国北方民众最重要的能量来源和矿质来源，其产量和品质直接关系到中国居民的生存安全和健康质量。但是，现有主栽小麦品种籽粒中有益微量元素特别是Zn、Fe和Se的质量分数低，生物有效性差[7]，普通小麦铁和锌质量分数的变异范围分别为23～88 mg/kg和13.5～76.2 mg/kg[8]。因此，提高小麦籽粒中有益微量元素的质量分数，特别是对人体影响较大的Zn、Fe和Se质量分数，是解决中国乃至全世界所面临的微量元素营养匮乏问题的重要途径[9]。种质资源是作物遗传改良的物质基础，也是生物学研究的重要材料[10]。二粒小麦(T.dicoccoides,2n=4x= 28,AABB)，又称为四倍体小麦，是普通小麦的A、B染色体组的供体，包括野生二粒小麦(T.dicoccoidesKoern.)、硬粒小麦(T.durumL.)和圆锥小麦(T.turgidumL.)等多种类型[11]，具有穗大、粒大、贮藏蛋白遗传多样性丰富及微量元素质量分数高等优良性状[12-13]。同时，作为普通小麦的祖先种，二粒小麦易与普通小麦杂交，不存在生殖隔离，杂种后代结实率较高，因而在小麦育种中有着重要的应用价值，是普通小麦改良的重要遗传资源[14-15]。因此，发掘野生二粒小麦、硬粒小麦等二粒小麦中高微量元素质量分数的种质材料，鉴定其优异基因并利用育种手段转入普通小麦中，将为高铁、高锌、高硒小麦新品种培育提供重要的数据支撑和优异种质资源，对丰富小麦微量元素育种的遗传基础尤其是小麦优质功能育种有着重要意义。

为鉴定、发掘二粒小麦中高铁锌优异种质，本研究对20份野生二粒小麦和30份硬粒小麦，利用空气-乙炔火焰法，测定和分析籽粒中Fe、Zn和Se元素的质量分数，以期鉴定和筛选出高微量元素质量分数的优异材料,为小麦微量元素强化育种和丰富小麦品质育种遗传基础提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料共计50份(表1)，包括硬粒小麦材料30份，野生二粒小麦20份，所有材料由西北农林科技大学农学院宋卫宁老师实验室保存并提供。

1.2 微量元素的测定

微量元素Zn、Fe和Se的质量分数测定采用火焰原子吸收分光光度法(FAAS)[16-17]。称取烘干的小麦籽粒样品10 g，置于瓷坩埚中，电炉上加热碳化后移入高温电炉中于525～550 ℃灰化3～4 h，烧至灰分近于白色为止；冷却至室温后加入体积比4∶1的硝酸、高氯酸混合溶液5 mL溶解灰分，溶解后移入50 mL容量瓶中，用ddH2O定容；然后再用干滤纸过滤，滤液收集于50 mL塑料瓶，利用原子分光光度计进行微量元素的测定，同时制作空白样品作对照。根据标准曲线计算溶液中Zn、Fe和Se元素的浓度，进而推算籽粒中各元素的质量分数。

Zn和Fe标准曲线制作：取7只50 mL容量瓶，加入Zn、Fe混合标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，再加入与待测溶液相同体积的硝酸或盐酸，用蒸馏水定容后备用。在样品测定时，在完全相同的条件之下，测定各标准溶液的吸收值，用于制作Zn和Fe标准曲线。

Se标准曲线的制作： 取10 mL Se标准液(100 μg/mL)于1 L容量瓶中，用φ=1%稀硝酸溶液定容，配置为1 μg/mL的Se标准使用液，然后取0、2、4、6、8、10 mL 标准使用液分别加入到6个100 mL容量瓶，用φ=1%硝酸定容备用，用于制作Se标准曲线。

Zn标准液(100 μg/mL)：将纯金属锌0.100 0 g于50 mL体积比为1∶1的盐酸溶液中溶解，然后用去离子水稀释定容至1 L；Fe标准液(500 μg/mL)：溶解0.500 0 g优纯级纯铁粉于体积比为1∶1的盐酸50 mL溶液，用去离子水定容至1 L；Zn、Fe混合标准液(Zn：10 μg/mL，Fe：50 μg/mL)：取Zn、Fe标准液各50 mL于500 mL容量瓶中，用去离子水定容，摇匀；Se标准液(100 μg/mL)：称取0.100 0 g元素硒(光谱纯)，溶于少量硝酸中，加2 mL过氯酸，置沸水浴中加热3～4 h，冷却后加入8.4 mL盐酸，定容至1 L。

1.3 数据处理

采用SPSS 20数据分析软件包进行方差分析和相关性分析，参照李瑞国等的方法[18]计算方差的贡献率。

2 结果与分析

2.1 硬粒小麦和野生二粒小麦籽粒微量元素的测定结果

利用火焰原子吸收分光光度法，对30份硬粒小麦和20份野生二粒小麦籽粒的Fe、Zn和Se 3种微量元素进行测定(表1)。结果显示，在硬粒小麦中，Fe、Zn和Se质量分数的最高值分别为57.55 mg/kg、55.92 mg/kg、164.02 μg/kg；而在野生二粒小麦中，3种微量元素质量分数最高的材料均为采集自以色列‘Mt Gilboa 2’，其Fe、Zn和Se的质量分数分别高达102.32 mg/kg、83.57 mg/kg和218.21 μg/kg，相较于硬粒小麦的最高材料，其微量元素质量分数分别达到1.78倍、1.49倍、1.33倍(图1)，是所有供试材料中Fe、Zn、Se质量分数最高的种质资源。在其余的野生二粒小麦材料中，‘Mt Hemon 88’‘IG 46282’‘IG 116187’及‘IG 46374’等各微量元素的质量分数也相对较高。在硬粒小麦中，品种‘Candeal’，‘Golden Ball’ 和‘Nanking’的微量元素质量分数也相对较高。同时，研究中也鉴定到一些某一种特定微量元素质量分数较高的材料。比如，野生二粒小麦品系‘Mt Hemon79’的Zn质量分数较高，而硬粒小麦品种‘Hamira’和‘Creten’的Se质量分数较高。

整体上，硬粒小麦Fe、Zn和Se的平均质量分数分别为44.46 mg/kg，32.23 mg/kg和104.94 μg/kg，变异系数分别为为0.17、0.24和0.33；而野生二粒小麦Fe、Zn和Se质量分数的平均值分别为59.20 mg/kg，55.34 mg/kg和85.40 μg/kg，变异系数分别为0.23、0.27和 0.58(表2)。相对于硬粒小麦，野生二粒小麦各微量元素变异幅度和变异系数均明显高于硬粒小麦，暗示了野生二粒小麦可能具有更高的遗传变异和遗传多样性。

表1 硬粒小麦与野生二粒小麦材料名称及其铁、锌、硒的质量分数Table 1 The mass fraction of Fe,Zn and Se in durum wheat and wild emmer wheat

图1 野生二粒小麦和硬粒小麦各元素最高质量分数品种(系)及其质量分数Fig.1 Comparing analysis of materials with the highest microelements mass fraction between wild wheat and durum wheat

表2 硬粒小麦和野生二粒小麦铁、锌和硒微量元素质量分数的统计分析Table 2 Statistics of the mass fraction of iron,zinc and selenium in durum and wild emmer wheat

2.2 硬粒小麦和野生二粒小麦籽粒微量元素的比较分析

进一步对硬粒小麦和野生二粒小麦的3种微量元素进行比较分析。整体上，野生二粒小麦中Fe、Zn元素的平均质量分数显著高于硬粒小麦，而Se的质量分数在野生二粒小麦和硬粒小麦间无显著差异。结合均值结果和单样本t检验，发现野生二粒小麦Fe、Zn质量分数高于硬粒小麦，且达到极显著水平(表3)。

表3 硬粒小麦与野生二粒小麦单样本t检验结果Table 1 t-test of Fe,Zn and Se contents between durum wheat and wild emmer wheat

2.3 硬粒小麦和野生二粒小麦中各微量元素相关性和贡献率分析

本研究进一步探究了供试材料中各微量元素质量分数间的相关性，通过计算各微量元素间的相关系数，硬粒小麦Fe质量分数与Zn质量分数间呈极显著正相关；野生二粒小麦中Fe质量分数、Zn质量分数、Se质量分数互相呈极显著正相关；四倍体小麦籽粒中Fe质量分数与Zn质量分数、Fe质量分数与Se质量分数均呈极显著正相关，而Zn质量分数与Se质量分数相关性未达到显著水平(表4)。

同时，对3种微量元素进行贡献因子分析率分析。由表5可知，二粒小麦微量元素质量分数前2个主成分的方差贡献率分别为63.82%、28.92%，前2个主成分的特征值累计贡献率达92.74%，暗示前2个主成分保留了绝大部分差异信息。第一主成分中，Fe、Zn质量分数的载荷值较Se大且二者均为正值，说明Fe、Zn对第一主成分起主要贡献，说明这二者间存在一定的正相关性；而第二主成分中，Se的载荷值较大，达到0.982，明显高于另外两个元素，说明Se对第二主成分起主要作用。

表4 硬粒小麦和野生二粒小麦各微量元素质量分数相关性分析Table 4 Relation analysis of all microelements between durum wheat and wild emmer wheat

表5 方差极大正交旋转因子载荷阵Table 5 The factor matrix after varimax rotation

3 讨 论

麦类近缘种是小麦遗传改良种质创新最重要的基因库。本研究以四倍体野生二粒小麦和硬粒小麦为研究材料，通过测定和分析其籽粒中微量元素Fe、Zn和Se质量分数，以期从中挖掘优异种质，用于小麦微量元素质量分数的强化育种。结果发现，野生二粒小麦和硬粒小麦中蕴含丰富的微量元素遗传资源。

Liu等[1]比较了186份中国的普通小麦微量元素的质量分数，发现Fe和Zn的质量分数分别为40.3 mg/kg和23.3 mg/kg，明显低于本研究中硬粒小麦的44.46 mg/kg和32.23 mg/kg以及野生二粒小麦的59.20 mg/kg和55.34 mg/kg，表明四倍体小麦Fe、Zn、Se微量元素质量分数较高，从中可鉴定一批Fe、Zn和Se质量分数高的优异种质材料，如野生二粒小麦中3种微量元素质量分数均很高的‘Mt Hemon 88’‘IG 46282’‘IG 116187’及‘IG 46374’，锌质量分数较高的‘Mt Hemon79’，硬粒小麦中‘Candeal’，‘Golden Ball ’和‘Nanking’微量元素质量分数也都较高，‘Hamira’和‘Creten’Se质量分数较高。这些材料都可作为普通小麦Fe、Zn、Se遗传改良的潜在种质资源[19]。

不同品种(系)间微量元素质量分数存在明显差异。整体上，野生二粒小麦品系间的变异系数、变异范围以及极差等都明显大于硬粒小麦各品种，表明野生材料微量元素比栽培材料具有更高的遗传变异，同时，野生二粒小麦的Fe、Zn质量分数平均值大于硬粒小麦，但野生二粒小麦Se质量分数的平均值小于硬粒小麦，暗示籽粒Se质量分数可能在长期的驯化和遗传改良中受到了人工选择的强化作用。Se作为对人类健康最重要的微量元素之一，通常在小麦籽粒中质量分数较低,而且外源增施对其吸收和富集影响不大[20]，因而运用遗传学手段提高小麦籽粒Se质量分数是最经济有效的手段。本研究发现野生二粒小麦和硬粒小麦中各品系间Se质量分数具有明显差异，同时，野生二粒小麦Se质量分数的变幅也远远大于Fe、Zn，因而，野生二粒小麦中的高Se材料，对于选育高Se小麦品种具有重要价值。而且野生二粒小麦中具有多个优异的高Se资源，野生二粒小麦品系‘Mt Gilboa 2’Se质量分数高达218.21 mg/kg，远远高于其他材料。进一步分析发现，品系‘Mt Gilboa 2’除了Se质量分数最高，其Fe、Zn质量分数也是所有供试材料中最高的，是十分优异的高微量元素种质资源，可作为小麦高Se遗传改良的宝贵种质材料，也可作为麦类Se吸收、转运和富集分子机理研究的重要材料。

3种微量元素质量分数的相关性分析表明，硬粒小麦和野生二粒小麦籽粒Fe质量分数与Zn及Se的质量分数存在显著正相关，推测二粒小麦中Fe与Zn和Se的质量分数存在协同关系，而Zn和Se质量分数相关性不显著。贡献因子分析进一步得出Fe与Zn对第一主成分起作用，从而在Fe与Zn的性状选择上存在一定的相关性，这也验证了相关性分析的结论。前人研究发现，增施氮肥可以提高小麦籽粒中的微量元素质量分数，表明小麦籽粒微量元素的质量分数受到环境的影响[21-22]。本研究发现四倍体小麦籽粒中质量分数与Zn及Se的质量分数存在显著相关性，暗示提高籽粒中Fe质量分数可以协同提高Zn和Se的质量分数，为四倍体乃至六倍体小麦的微量元素生物强化育种和协调改良提供了有益信息。

参考文献Reference：

[1] LIU Z H,WANG H Y,WANG X E,etal.Genotypic and spike positional difference in grain phytase activity,phytate,inorganic phosphorus,iron,and zinc contents in wheat [J].JournalofCerealScience,2006,44(2):212-219.

[2] XUE Y F,XIA H Y,MCGRATH S P,etal.Distribution of the stable isotopes 57Fe and 68Zn in grain tissues of various wheat lines differing in their phytate content [J].PlantandSoil,2015,396(1):73-83.

[3] TIWARI C,WALL WORK H,ARUN B,etal.Molecular mapping of quantitative trait loci for zinc,iron and protein content in the grains of hexaploid wheat [J].Euphytica,2016,207(3):563-570.

[4] LI M,WANG S,TIAN X,etal.Zn distribution and bioavailability in whole grain and grain fractions of winter wheat as affected by applications of soil N and foliar Zn combined with N or P [J].JournalofCerealScience,2015,61(9):26-32.

[5] RACHON L,SZUMILO G,BRODOWSKA M,etal.Nutritional value and mineral composition of grain of selected wheat species depending on the intensity of a production technology [J].JournalofElementology,2015,20(3):705-715.

[6] PELEG Z,SARANGA Y,KRUGMAN T,etal.Allelic diversity associated with aridity gradient in wild emmer wheat populations[J].Plant,CellandEnvironment,2008,31(1):39-49.

[7] NEI M,MARUYAMA T,CHKRABORTY R.The bottleneck effect and genetic variability in populations[J].Evolution,1975,29(1):1-10.

[8] 张 勇,郝元峰,张 艳,等.小麦营养和健康品质研究进展[J].中国农业科学,2016,49(22):4284-4298.

ZHANG Y,HAO Y F,ZHANG Y,etal.Progress in research on genetic improvement of nutrition and health qualities in wheat [J].ScientiaAgriculturaSinica,2016,49(22):4284-4298.

[9] 杨莉琳,刘小京,徐 进,等.小麦籽粒微量元素含量的研究进展[J].麦类作物学报,2008,28(6):1113-1117.

YANG L L,LIU X J,XU J,etal.Progress in research of micronutrients content in wheat grain [J].JournalofTriticeaeCrops，2008,28(6):1113-1117.

[10] GUZMAN C,MEFINA-LARQUE A S,VELU G,etal.Use of wheat genetic resources to develop biofortified wheat with enhanced grain zinc and iron concentrations and desirable processing quality [J].JournalofCerealScience,2014,60(3):617-622.

[11] ZOHARY D.Wild genetic resources of crops in Israel[J].IsraelJournalofBotany,1983,32(2):97-127.

[12] NEVO E,KOROL A B,BEILES A,etal.Evolution of Wild Emmer and Wheat Improvement:Population Genetics,Genetic Resources and Genome Organization of Wheat Sprogenitor,Triticumdicoccoides[M].Berlin:Springer Press,2002.

[13] UAUY C,DISTELFELD A,FAHIMA T,etal.A NAC gene regulating sensecensce improves grain protein,zinc,and iron contents in wheat [J].Science,2006,314(5803):1298-1301.

[14] XIE W,NEVO E.Wild emmer:genetic resources,gene mapping and potential for wheat improvement [J].Euphytica,2008,164(3):603-614.

[15] NEVO E. Origin,Evolution,Population Genetics and Resources for Breeding of Wild Barley,Hordeum spontaneum,in the Fertile Crescent[M]// SHEWRY P R. Barley: Genetics,Biochemistry,Molecular Biology and Biotechnology. Oxford: CAB International Press,1992:19-43.

[16] 杨惠芬,李明元,沈 文.食品卫生理化检验标准手册 [M].北京:中国标准出版社,1997:1-50.

YANG H F,LI M Y,SHEN W.Food Hygiene and Chemical Inspection Standard Manual [M].Beijing:Standards Press of China,1997：1-50.

[17] 张东亮,李友军,寇太记,等.小麦籽粒铁锰铜锌含量提取方法比较 [J].河南科技大学学报(自然科学版),2015,36(3):81-85.

ZHANG D L,LI Y J,KOU T J,etal.Comparison of different extracted methods of Fe,Mn,Cu and Zn concentration of wheat grain [J].JournalofHenanUniversityofScienceandTechnology(NaturalScience),2015,36(3):81-85.

[18] 李瑞国,高冬丽,柴 岩,等.苦荞资源农艺性状因子聚类分析 [J].干旱地区农业研究,2007,25(6):80-84.

LI R G,GAO D L,CHAI Y,etal.Factor and cluster analysis of tartary buckwheat resources [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2007,25(6):80-84.

[19] CHHUNEJA P,DHALIWAL H S,BAINS N S,etal.Aegilops kotschyi andAegilopstauschiias sources for higher levels of grain iron and zinc [J].Plantbreeding,2006,125(5):529-531.

[20] 刘 庆,田 侠,史衍玺.施硒对小麦籽粒硒富集、转化及蛋白质与矿质元素含量的影响 [J].作物学报,2016,42(5):778-783.

LIU Q,TIAN X,SHI Y X.Effects of Se application on Se accumulation and transformation and content of gross protein and mineral elements in wheat grain [J].ActaAgronomicaSinica,2016,42(5):778-783.

[21] 常旭虹,赵广才,王德梅,等.生态环境与施氮量协同对小麦籽粒微量元素含量的影响 [J].植物营养与肥料学报,2014,20(4)：885-895.

CHANG X H,ZHAO G C,WANG D M,etal.Effects of ecological environment and nitrogen application rate on microelement contents of wheat grain [J].JournalofPlantNutritionandFertilizer,2014,20(4):885-895.

[22] 黄文川,李录久,李文高.小麦氮锌配施效应及增产机理研究 [J].核农学报,2000,14(4):225-229.

HUANG W CH,LI L J,LI W G.Effect of applying nitrogen combined with zinc on wheat yield [J].ActaAgriculturaeNucleataeSinica,2000,14(4):225-229.