葶苈子雌激素样活性筛选及其作用机制研究

韩杜菀，郑晓珂，赵莹莹，陈 燕， 杨胜利，孙亚萍，克迎迎

(河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046)

植物雌激素是天然存在的一种植物成分，因其与雌激素受体(estrogen receptor，ER)特异性结合的不同，可产生雌激素或抗雌激素双向活性[1]。相对于合成的雌激素，植物雌激素因具有不良反应小、安全性高、生物活性广泛等特点而备受关注[2]。

葶苈子为十字花科植物播娘蒿Descurainiasophia(L) Webb. ex Prantl.的干燥成熟种子，称“南葶苈子”；或者独行菜LepidiumapetalumWilld.的干燥成熟种子，称“北葶苈子”。葶苈子记载于《神农本草经》，被归为下品，药味辛、苦；性大寒；归肺、膀胱经。文献报道，其主要有止咳平喘[3]、利尿[4]、强心[5]等作用。但是葶苈子是否具有雌激素样活性，却未见报道。本研究筛选了葶苈子水提物(SemenDescurainiaeaqueous extracts，SD-ae)的雌激素样活性，并研究其有效雌激素样化学拆分组分及其作用机制，同时对比人工合成的雌激素和葶苈子雌激素作用分子机制的异同，为植物雌激素类新药的研发及临床用药提供理论支撑。

1 材料

1.1药物葶苈子购自河南省郑州市中药材市场，经过河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定为十字花科植物播娘蒿DescurainiaSophia(L)Webb ex Prantl.的干燥成熟种子。称取葶苈子(SD)1 kg包煎，10倍量水煎煮3次，每次1 h，滤液过滤合并，减压干燥浓缩即得SD-ae，提取率为11.4%。SD经水蒸气蒸馏得到挥发油拆分组分(SD-VO)，提取率为0.04%；SD用石油醚萃取得到石油醚组分[脂肪油拆分组分(SD-FO)]，提取率为27.17%；SD-ae浓缩后，上DiaionHP-20柱，依次用水、20%乙醇、80%乙醇洗脱，即得到低聚糖拆分组分(SD-ae-Oli)、多糖拆分组分(SD-ae-Pol)、黄酮苷拆分组分(SD-ae-FG)、黄酮苷元拆分组分(SD-ae-FA)，提取率分别为5.12%、2.61%、0.98%、0.60%。阳性药戊酸雌二醇(estradiol valerate，EV，拜耳医药)，将其制成蒸馏水混悬液，按0.33 mg·kg-1·d-1给药。

1.2试剂Steady-Glo稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Cat.No.253B)、闪亮裂解缓冲液(Cat.No.E266A)均购自Promega公司；超纯RNA提取试剂盒(Cat.No.CW0597)、Ultra SYBR Mixture(Cat.No.CW0956)均购自康为世纪生物科技有限公司；第一链cDNA合成试剂盒(Cat.No.k1622)、无酚红高糖DMEM(Cat.No.SH30211.15)购自Thermo公司；胎牛血清(Cat.No.SH30068.03)购自Hyclone公司；17β-雌二醇(17β-estrogen，17β-E2，Cat.No.E2758)、雌激素受体拮抗剂Fulvestrant(ICI182,780，Cat.No.14409) 购自Sigma公司。

1.3仪器Mastercycler ep realplex实时荧光定量PCR仪(Eppendorf公司)；iMarkTM型酶标仪(Bio-Rad公司)；紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4实验动物、细胞株及质粒SPF级♀昆明种小鼠，刚断乳(21 d)，体质量9～12 g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。人乳腺癌细胞MCF-7购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；人胚胎肾细胞株(HEK293)源于中国典型培养物保藏中心。pCXN2-hERα、pCXN2-hERβ、pβgal-Control、pERE-TAL-luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。

2 方法

2.1小鼠子宫增重实验小鼠称重后，以均重随机分组，给药7 d。正常组按0.02 mL·g-1·d-1灌胃蒸馏水；阳性组隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33 mg·kg-1·d-1)。首先对葶苈子水提物进行雌激素样活性筛选，实验分组为:正常组(NC)、阳性组(EV)、葶苈子低剂量组(2015版药典规定人用药量的20倍量×提取率)、葶苈子高剂量组(2015版药典规定人用药量的40倍量×提取率)，按0.02 mL·g-1·d-1灌胃。然后对葶苈子各化学拆分组分进行雌激素样活性筛选，实验分组为：正常组(NC)、阳性组(EV)、黄酮苷拆分组分组(SD-ae-FG)、黄酮苷元拆分组分组(SD-ae-FA)、低聚糖拆分组分组(SD-ae-Oli)、多糖拆分组分组(SD-ae-Pol)、脂肪油拆分组分组(SD-FO)、挥发油拆分组分组(SD-VO)、葶苈子低剂量组(SD-ae-L，葶苈子各拆分组分按人用药量的20倍量×提取率计算，剂量为0.02 mL·g-1·d-1)。最后一次给药后，禁食12 h后称重，脱颈椎处死小鼠，即刻摘取子宫称重，计算子宫系数：子宫系数=子宫湿重×(体质量)-1×100%。实验独立平行重复3次。

2.2E-SCREEN实验无酚红高糖DMEM培养基加入5%经活性炭-葡聚糖处理的胎牛血清，用于培养MCF-7细胞。培养1周以消除细胞中内源性雌激素的干扰，待细胞长至约90%，调整细胞密度为6×107·L-1，以每孔200 μL接种于96孔板内，待细胞贴壁后，给药培养48 h，MTT法检测各药物对细胞活力的影响，结果以平均吸光度(A)值和增殖率(proliferation rate, PR)表示，实验独立重复3次。17β-E2为阳性药，按照说明书要求稀释至所需实验浓度。

2.3ICI182,780干预阻断实验实验方法同“2.2”，其中给药培养时，ICI182,780干预阻断组在给药前2 h加入ICI182,780(10-8mol·L-1)。

2.4雌激素反应元件(estrogenresponsealements，ERE)调控的报告基因在HEK293细胞中的瞬时表达检测调整HEK293细胞浓度为3.2×108·L-1，每孔0.5 mL细胞悬液接种于24孔板，在含10%的胎牛血清(经活性炭-葡聚糖处理)无酚红DMEM培养液中培养，待细胞长至90%时，把已构建好的重组质粒pERE-TAL-Luc、pβgal-Control、pCXN2-hERα、pCXN2-hERβ以阳离子脂质体转染法共同转入HEK293细胞，6 h后给药干预，24 h后计算标准化Luc活性。

2.5实时荧光定量PCR检测ERα、ERβ、孕激素受体(progesteronereceptor，PR)mRNA的表达小鼠子宫保存于-80 ℃冰箱中，按说明书以超纯RNA提取试剂盒操作，提取的RNA用琼脂糖凝胶电泳法检测完整性。参照第一链cDNA合成试剂盒说明书，将RNA逆转录为第一链cDNA。选取β-actin作为内参基因，ERα、ERβ、β-actin基因序列参照文献[6]。PR基因由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，引物序列：PR引物上游5′-CATGGTCCTTGGAGGTCGTA-3′，下游5′-CTCTCGTTAGGAAGGCCCAC-3′。参照Ultra SYBR Mixture 试剂盒说明书进行荧光定量扩增，PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火/延伸1 min，40个循环。熔解曲线分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。按照2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

3 结果

3.1小鼠子宫增重实验结果

3.1.1SD-ae对小鼠子宫系数的影响 如Tab 1所示，与正常组相比，SD-ae低、高剂量组与阳性药戊酸雌二醇均能明显增加小鼠子宫系数(P<0.01或P<0.05) 。说明SD-ae在体内具有雌激素样作用。

Tab 1 Effect of SD-ae on uterus index of

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.1.2葶苈子各化学拆分组分对小鼠子宫系数的影响 如Tab 2所示，与NC组相比，SD-ae-Oli组、SD-ae-Pol组、EV组小鼠子宫系数明显升高(P<0.01，P<0.05)，说明SD-ae-Oli和SD-ae-Pol是发挥雌激素样活性的有效化学拆分组分。SD-ae-FG、SD-ae-FA、SD-FO、SD-VO组与NC组相比，差异无统计学意义。

Tab 2 Effect of chemical separation components of SD on uterus index of immature female n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.2MCF-7细胞增殖实验结果

3.2.1SD-ae对MCF-7细胞的促增殖作用 与NC组相比，SD-ae浓度为10-7、2×10-8、4×10-9、8×10-10mg·L-1时，对MCF-7细胞有明显的促增殖作用(P<0.01)。说明SD-ae在体外具有雌激素样作用。见Tab 3。

Tab 3 Effect of SD-ae on proliferation of

**P<0.01vsNC

3.2.2SD-ae-Oli对MCF-7细胞的促增殖作用 SD-ae-Oli(2×10-3、10-3mg·L-1)能明显促进MCF-7细胞的增殖(P<0.01)，说明SD-ae-Oli在体外具有雌激素样活性(Tab 4)。

Tab 4 Effect of SD-ae-Oli on proliferation of

**P<0.01vsNC

3.2.3SD-ae-Pol对MCF-7细胞促增殖作用 SD-ae-Pol(2×10-3、10-3mg·L-1)能明显促进MCF-7细胞的增殖(P<0.01)，说明SD-ae-Pol在体外具有雌激素样活性(Tab 5)。

Tab 5 Effect of SD-ae-Pol on proliferation of

**P<0.01vsNC

3.3ICI182,780干预阻断实验结果

3.3.1ICI182,780对SD-ae促MCF-7细胞增殖的影响 与NC组相比，SD-ae各剂量组均可明显促进MCF-7细胞的增殖(P<0.01)。当SD-ae与ICI182,780共同处理MCF-7细胞时，SD-ae的促增殖作用消失，与NC组相比差异无统计学意义(Tab 6)。说明SD-ae对MCF-7细胞的促增殖作用是通过雌激素受体途径发挥的。

3.3.2ICI182,780对SD-ae-Oli促MCF-7细胞增殖的影响 当加入ICI182,780后，SD-ae-Oli对MCF-7细胞的促增殖作用消失(Tab 7)，说明SD-ae-Oli的促增殖作用是通过雌激素受体途径发挥的。

Tab 6 Effects of ICI182, 780 on proliferation of

**P<0.01vsNC

Tab 7 Effects of ICI182, 780 on proliferation of MCF-7 cells in SD-ae-Oli n=6)

**P<0.01vsNC

3.3.3ICI182,780对SD-ae-Pol促MCF-7细胞增殖的影响 当加入ICI182,780后，SD-ae-Pol对MCF-7细胞的促增殖作用消失(Tab 8)，说明SD-ae-Pol的促增殖作用是通过雌激素受体途径发挥的。

Tab 8 Effects of ICI182, 780 on proliferation of MCF-7 cells in SD-ae-Pol n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.4ERE调控的报告基因在HEK293细胞中的瞬时表达检测结果

3.4.1SD-ae对ERE调控的报告基因表达的诱导作用 由ERα介导时，SD-ae各组标准化Luc活性与正常组相比，差异无统计学意义；由ERβ介导时，SD-ae(5×10-5mg·L-1)标准化Luc活性明显高于正常组(P<0.01)，见Tab 9。说明SD-ae可经过ERβ途径激活基因转录，发挥雌激素样作用。

Tab 9 Inductive effects of SD-ae on ERE-regulated reporter gene of transient expression when mediated by ERα, n=3)

**P<0.01vsNC

3.4.2SD-ae-Oli对ERE调控的报告基因表达的诱导作用 如Tab 10所示，由ERα介导时，SD-ae-Oli各浓度标准化Luc活性与NC组相比，差异无统计学意义，说明SD-ae-Oli不是通过ERα发挥雌激素样作用的。由ERβ介导时，SD-ae-Oli(2×10-3mg·L-1)标准化Luc活性明显高于NC(P<0.05)，说明SD-ae-Oli是通过ERβ途径激活基因转录，发挥雌激素样作用。

Tab 10 Inductive effects of SD-ae-Oli on ERE-regulated reporter gene of transient expression when mediated by ERα, n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.4.3SD-ae-Pol对ERE调控的报告基因表达的诱导作用 如Tab 11所示，由ERα介导时，SD-ae-Pol各浓度标准化Luc活性与NC组相比，差异无统计学意义，说明SD-ae-Pol不是通过ERα发挥雌激素样作用的。由ERβ介导时，SD-ae-Pol(2×10-3、10-3mg·L-1)标准化Luc活性明显高于NC组(P<0.01)。说明SD-ae-Pol是通过ERβ途径激活基因转录，发挥雌激素样作用。

3.5SD-ae-L对ERαmRNA、ERβmRNA、PRmRNA表达的影响Fig 1的实时荧光定量PCR结果显示，与NC组相比，EV可明显降低子宫中ERα mRNA、ERβ mRNA的表达(P<0.01)，明显升高孕激素受体PR mRNA表达(P<0.01)，SD-ae-L能明显升高子宫中ERβ mRNA的表达(P<0.01)。

Tab 11 Inductive effects of SD-ae-Pol on ERE-regulated reporter gene of transient expression when

**P<0.01vsNC

Fig 1 Effects of SD-ae-L on ERα mRNA, ERβ mRNA,

**P<0.01vsNC

4 讨论

靶器官子宫中富含ER，具有雌激素活性的化合物与ER结合后，会使子宫增重[7]。本研究采用小鼠子宫增重实验对SD-ae及其化学拆分组分进行体内雌激素样活性的筛选。研究结果表明，SD-ae能够明显增加小鼠子宫系数，首次发现SD-ae在体内具有雌激素样作用。为了进一步明确SD-ae中的有效组分，本研究将SD-ae按照组分间互不交叉的原则，进行化学拆分[8]，并采用小鼠子宫增重实验，筛选有效雌激素样活性组分。研究发现，SD-ae-Oli和SD-ae-Pol可明显增加小鼠子宫系数，在体内具有雌激素样作用，推测葶苈子的雌激素样活性成分可能是低聚糖和多糖成分。动物实验选用天然雌二醇的戊酸盐EV作为阳性药，其在体内代谢后生成天然雌激素17β-雌二醇，与内源性雌激素结构相同。其作为一种外源性雌激素，因具有易吸收、不良反应小等特点，优于人工合成的雌激素己烯雌酚[9]。

E-SCREEN实验是目前国内外较为常用的体外检测雌激素的方法，因高灵敏度、高效率、快速简便，广泛应用于体外雌激素活性筛选[10]。实验常选用ER阳性细胞株MCF-7和T47D细胞，雌激素样活性物质通过与ER结合，可使ER阳性细胞增殖。因此，本研究选用MCF-7细胞增殖实验对SD-ae及其化学拆分组分进行体外雌激素样活性评价，并在ER拮抗剂ICI182,780干预下，初步探讨其雌激素样活性是否通过ER途径而发挥。结果表明，SD-ae、SD-ae-Oli和SD-ae-Pol都能明显促进MCF-7细胞增殖，说明其在体外具有雌激素样活性，且ICI182,780能分别阻断SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol对MCF-7细胞的增殖作用，表明SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol的雌激素样活性是通过ER途径发挥的。

经典的ER有两种亚型，即ERα、ERβ[11]。为了进一步研究SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol通过何种受体发挥雌激素样作用，本研究以pERE-TAL-Luc构建报告基因载体，同时和ERα、ERβ表达载体转入HEK293细胞中，以Luc活性来评判SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol对ERα和ERβ亲和力的大小。结果显示，SD-ae、SD-ae-Oli、SD-ae-Pol与ERβ的亲和力大于ERα，说明其可通过ERβ介导激活基因转录，发挥雌激素样作用。这也再次印证了植物雌激素似乎对ERβ具有更高的亲和力，与文献报道一致[12]。

植物雌激素和雌激素对下游靶基因转录具有激活或抑制的作用。因此，本研究通过实时荧光定量PCR技术对小鼠子宫中ER、PR mRNA的表达进行检测，探讨EV与SD-ae在小鼠体内发挥雌激素样作用的分子机制的异同。本研究中，EV能明显降低小鼠子宫ERα、ERβ mRNA的表达，且能够明显增加PR mRNA的表达；SD-ae能明显升高小鼠子宫中ERβ mRNA的表达，但对ERα、PR mRNA的表达却没有明显影响。这就表明雌激素和植物雌激素通过不同的作用靶点使子宫中的靶蛋白含量增加，从而使小鼠子宫增重。

综上所述，本研究首次发现SD-ae具有雌激素样活性，其有效拆分组分为SD-ae-Oli和SD-ae-Pol，为进一步研究葶苈子中雌激素样活性成分奠定了基础。人工合成的雌激素副作用大，而植物雌激素不良反应少、安全性高，这可能与其作用机制的不同有关，本研究证实，SD-ae通过ERβ介导激活基因转录而发挥雌激素样作用，这与人工雌激素有很大不同。这一结果为开发安全、有效的雌激素类新药提供了理论依据。

(致谢: 本文实验是在河南中医药大学药学院中药活性成分筛选实验室完成，谨此致谢。)

[1] 陈 嫱, 李文兰, 丁振铎,等. 中药植物雌激素双向调节的机制研究[J]. 哈尔滨商业大学学报(自然科学版), 2014,30(2):138-41.

[1] Chen Q, Li W L, Ding Z D, et al. Study on two-way adjustment mechanism of traditional Chinese medicine phytoestrogens[J].JHarbinUnivCommerce, 2014,30(2):138-41.

[2] 袁婷婷, 张乃丹, 何勇静,等. 天然药物中植物雌激素样化学成分的研究进展[J]. 中国中药杂志, 2014,39(23):4526-31.

[2] Yuan T T, Zhang N D, He Y J, et al. Research progress of phytoestrogens-like chemical constituents in natural medicines[J].ChinaJChinMaterMed, 2014,39(23):4526-31.

[3] 杨 云, 赫金丽, 孙亚萍,等. 葶苈子化学拆分组分止咳祛痰平喘作用研究[J]. 世界科学技术:中医药现代化, 2015,17(3):514-9.

[3] Yang Y, He J L, Sun Y P, et al. Study on antitussive, expectorant and antiasthmatic effect of chemical split fractions ofDescurainiasophia(L.) Webb. ex Prantl[J].WorldSciTechnol:ModernizTraditChinMedMaterMed, 2015,17(3):514-9.

[4] 张晓丹, 范春兰, 余迎梅,等. 葶苈子水提液对CHF大鼠利尿作用的影响[J]. 中国现代应用药学, 2010,27(3):210-3.

[4] Zhang X D, Fan C L, Yu Y M, et al. Diuretic effect of aqueous extract of Tinglizi on CHF rats[J].ChinJModApplPharm, 2010,27(3):210-3.

[5] 孙志强, 李 超, 吴源鸿,等. 南葶苈子提取液对心力衰竭大鼠心功能的影响[J]. 心脑血管病防治, 2016,16(6):427-30.

[5] Sun Z Q, Li C, Wu Y H, et al. Effects of Descurainiae extract on cardiac function in heart failure rats[J].PrevTreatCardio-Cerebral-VascularDis, 2016,16(6):427-30.

[6] 王晓帆, 马利刚, 韩杜菀,等. 车前子水提物雌激素样作用筛选及机制探讨[J]. 中国新药杂志, 2016,25(10):1191-6.

[6] Wang X F, Ma L G, Han D W, et al. Estrogenic effect of Plantaginis Semen aqueous extracts and the action mechanism[J].ChinJNewDrugs, 2016,25(10):1191-6.

[7] Branham W S, Zehr D R, Sheehan D M. Differential sensitivity of rat uterine growth and epithelium hypertrophy to estrogens and antiestrogens[J].ProcSocExpBiolMed, 1993,203(3):297-303.

[8] 张明辉, 张艳丽, 赵 威,等. 南葶苈子化学拆分工艺研究[J]. 世界科学技术:中医药现代化, 2015,17(3):476-84.

[8] Zhang M H, Zhang Y L, Zhao W, et al. Research on fraction-splitting technology of seeds of Descurainia Sophia[J].WorldSciTechnol:ModernizationTraditChinMedMaterMed, 2015,17(3):476-84.

[9] 王凯怡, 董 婕. 不同剂量戊酸雌二醇用于中、重度宫腔黏连术后辅助治疗的临床疗效观察[J]. 生殖与避孕, 2015,35(3):166-71.

[9] Wang K Y, Dong J. Effects of different doses of estrogen on endometrium restoration after separation of moderate or severe intrauterine adhesions[J].ReprodContracep, 2015,35(3):166-71.

[10] 毛旭文, 张 莉, 杜冠华,等. 孕马尿提取物中4种化学成分的雌激素活性研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(9):1304-9.

[10] Mao X W, Zhang L, Du G H, et al. Estrogenic activities of four components from pregnant mare’s urine extract[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(9):1304-9.

[11] 司玲玲, 马 俊, 任欢欢,等. 刺槐素对乳腺癌 T47D 细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2017,33(2):260-7.

[11] Si L L, Ma J, Ren H H, et al. Effects of acacetin on T47D cell proliferation[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(2):260-7.

[12] 张 华, 李红芳, 杨丽娜,等. 雌激素及植物雌激素对去卵巢大鼠乳腺组织形态和ERα亚型表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2008,24(4):518-22.

[12] Zhang H, Li H F, Yang L N, et al. Effects of estrogen and phytoestrogens on themorphology and ERα expression in breast tissue of ovariectomized rats[J].ChinPharmacolBull, 2008,24(4):518-22.