重金属污染对稻田共生黑斑蛙毒性影响研究

何志刚 伍远安* 王冬武 徐永福, 李金龙 陈建国

（1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙，410153；2.南县丰年生态黑斑青蛙养殖有限公司，湖南益阳，413200）

日益严重的环境污染与当前黑斑蛙种群数量急剧锐减有密切关系。不仅残留的除草剂和杀虫剂对黑斑蛙造成毒害，重金属污染对黑斑蛙造成的毒害亦极为严重。鉴于黑斑蛙等蛙类独特的生活史和各发育阶段的皮肤均具高渗透性，重金属极易进入其体内，进而对该类动物造成毒害这一特点，学界普遍认为黑斑蛙等蛙类胚胎及幼体的存活状况能够敏感地反映水质，可用于评价和控制工业排放物，是监测水质的适宜前哨物种之一。黑斑蛙由于其皮肤的高渗透性、水陆两栖等生物学特性，对环境污染极其敏感，其种群的变化与环境污染物有密切的关系。黑斑蛙皮肤具有渗透水分和交换气体的能力，其卵膜也具有半渗透性。黑斑蛙蝌蚪生活在水环境中，化学污染物可以通过水中积累对其产生胁迫。植物性水环境致使水生植物对污染物的富集放大作用通过食物链对黑斑蛙的正常发育和生存产生了很大作用。水环境周围的一些小型动物通过食物链积累污染物，变态后的黑斑蛙多数食用这些动物，通过食物链进一步放大致使中毒。

稻田是黑斑蛙长期自然生存的环境之一，稻田重金属污染对黑斑蛙的早期发育具有明显的影响。这种影响主要表现为能使处于孵化期和开口期的胚胎致死（致死率随浓度的升高而升高）以及影响蝌蚪的正常发育（发育缓慢及畸形）。随着我国化工业的迅猛发展，化工业废料所造成的环境污染也愈来愈严重。某些废料中含有大量的重金属离子，如果对这些废料不加处理直接排入水中，将会对包括黑斑蛙在内的所有水生生物产生影响。这不仅不利于渔业发展，并且重金属离子通过生物链的级联放大作用逐级传递并逐渐累积，将会对终极消费者人类产生极大的危害。

一、重金属的毒性机理

动物生长发育本身需要矿物元素 （如Cu2+、Zn2+、Mn2+等），过量吸收重金属才会有害。重金属的毒性机理较为复杂，已提出的毒性机理包括离子及分子模拟、干扰细胞黏附和通信、氧化应激、细胞凋亡、遗传毒性（DNA损伤）、细胞周期紊乱等。目前 Cd2+、Pb2+、Cu2+等重金属对蛙蟾类的毒害，多是从氧化应激角度开展的研究，过量的重金属能导致体内产生大量的活性氧自由基，这些活性氧自由基可以引起DNA单链或双链的断裂、生物大分子和脂质过氧化、膜脂质过氧化及酶失活等，引起机体氧化应激，进而引起一系列生理生化代谢紊乱，导致伤害发生，甚至死亡。另外，许多重金属能与蛋白质、酶、谷胱甘肽等中所含的SH基团发生作用，形成牢固的硫醇基，从而使一些物质的功能受到抑制，破坏细胞的基本代谢。重金属进入蛙体后，同时或先后作用于神经系统、肝脏和肾脏等“要害”器官，即产生多系统性、多器官性的毒害作用。

目前重金属污染对黑斑蛙毒性影响的研究多是采用急性毒性试验，虽然短期毒理测试较快、简便、费用低，但忽略了重金属的积累特性及其毒性的累积效应。暴露时间的长短对试验结果有重要影响，短期暴露可能忽略了重要的生态毒理学现象，很可能过高或过低估计了重金属的生态毒性。因此，有必要多从亚急性或慢性毒性角度来进一步研究重金属对蛙蟾类毒性的影响。由于工业废水多呈不连续排放，自然界中重金属污染物的存在也可能是断断续续的，研究水中重金属被 “清除”后，染毒动物的恢复情况亦极为重要。稻田环境中常有多种重金属同时存在的情况，而多种重金属共存时其联合毒性机理非常复杂，不能简单地由各单一重金属毒性相加来判断毒物的综合毒性。

黑斑蛙皮肤是毒物进入蛙体的主要途径。研究实验中，除了胚胎及蝌蚪都直接浸于毒液中，多数学者将黑斑蛙成体也浸置于毒液中，让毒物自然渗入动物体内，无论在时间上还是剂量上，更接近毒物实际进入过程；也有学者采用将毒物注射入动物腹腔或皮下的方法，虽然剂量容易控制，但蛙体生理生化反应可能偏激。

黑斑蛙重金属致死剂量，绝大多数实验者选择的指标是LC50（半致死剂量），但有些学者则采用分别观测和统计LC10、LC50和LC90这样更全面更准确的指标。

二、重金属对黑斑蛙的毒害效应

当稻田中某种或某几种重金属达到或超过一定浓度时，即会不同程度地对黑斑蛙胚胎、蝌蚪及蛙体造成多方面的毒害。除了造成死亡率上升外，还表现在以下若干方面。

重金属能增加卵胶膜的通透性，使胚胎能从外界获得更多的氧气而加快发育速度，进而缩短胚胎出膜时间。不同重金属透过卵胶膜进入胚胎内积累的量或对胚胎的毒性大小不一造成不同浓度影响出膜率效果不同。

重金属会不同程度地抑制蝌蚪发育，这很可能是重金属抑制甲状腺激素通路造成的，也有可能是重金属抑制红细胞的生成，造成供氧不足，能量利用率降低，代谢损耗增加，从而导致蝌蚪生长延缓。另外，体内积累大量重金属后，可能使动物的摄食量减少，最终导致个体生长缓慢，变态延迟。

重金属造成蝌蚪畸形主要表现为尾部异常弯折，这可能与尾部神经最易遭受重金属毒害有关。重金属不仅对蛙心脏、眼、中枢神经、骨骼产生致畸作用，精子生成、发育和活化受到抑制或精子出现畸形。

对染毒后蝌蚪、蛙蟾成体器官形态或组织显微结构观察发现，肝脏和肾脏组织结构受损，精巢血管受损，心肌、脊髓和脑结构受损。

由于尾部畸形，加上神经系统受损，蝌蚪对外界刺激反应的灵敏度及游泳运动能力下降。游泳能力的下降，进而导致蝌蚪反捕食能力降低。黑斑蛙受到低浓度重金属影响后虽能完成变态，但登陆幼蛙体形偏小或体重较小。这不仅造成黑斑蛙生存率下降，性成熟率也降低，同时较小的体形会降低生殖适合度，进而影响种群动态。

三、重金属对黑斑蛙的毒害影响

人类各种各样的生产活动，如污水灌溉、重金属制品以及化肥使用等造成的重金属污染一直是引人关注的环境问题。重金属离子具有很强的富集性，很难在环境中降解，且超过一定浓度后对黑斑蛙都有害，可以与蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使其失去活性，也可在某些器官中富集，造成黑斑蛙的急性中毒、亚急性中毒和慢性中毒等。

目前稻田研究较多的重金属为铅 （Pb2+）、镉（Cd2+）、铜（Cu2+）、锌（Zn2+）、硒（Se2+）、铝（Al3+）、铬（Cr3+）和汞（Hg2+）。在稻田实际种植环境中，污物中的重金属主要也是这几种。其中，研究最多，对黑斑蛙蝌蚪的毒性大小为 Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr3+＞Pb2+。

随着废水的排放，水域污染日益严重。其中铅是最常见的重金属之一，当铅离子浓度超过国家规定的农田水质标准时，就会对水生生物产生一定的毒害作用，进而对位于食物链上层的哺乳动物造成毒害。铅是生物体许多酶的抑制剂，其毒性机理主要是抑制血红素的合成，通过皮肤、消化道、呼吸道进入体内与多种器官结合，从而影响神经递质的代谢并产生多系统性、多器官性的毒害作用。铅对胚胎期的毒性于孵化期和开口期表现显著，能影响黑斑蛙胚胎期和蝌蚪期的生存率，对蝌蚪的生长发育具有明显的抑制作用。均导致蝌蚪头部泡状膨大、“S”型尾和形体较小。

汪美贞等（2012）以三种酶活性为指标，进行了长期铅暴露对雄性黑斑蛙生殖毒性的研究，随着铅染毒剂量的增加，Ca2+-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性被诱导，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性被抑制，当Ca2+-Mg2+-ATP酶的抑制程度超过前两种酶的代偿机制时，会抑制精子的发生，进而导致雄性生殖毒性；如细胞受损，精子总数受到影响，以及生精细胞受损，精子质量受到影响。施蔡雷等（2010）报道黑斑蛙精巢MDA含量随铅、镉暴露浓度的升高而明显增加，且呈明显的浓度-效应关系。说明低水平铅、镉的长期暴露对黑斑蛙精巢具有一定的损伤作用。GSH-Px活性对铅、镉暴露响应最敏感，是指示铅、镉暴露的优选生物标志物。

贾秀英等（2009）报道随铅染毒剂量的升高，黑斑蛙精子数量下降，精子畸形率呈剂量依赖性增加，精子活动率呈剂量依赖性降低，血清中T水平明显下降，E2水平则明显升高，且均呈剂量-效应关系。铅暴露对黑斑蛙精巢有明显的毒性作用。低水平铅的长期暴露可干扰生殖内分泌系统，造成生殖功能紊乱，从而对精巢组织造成一定的损害作用。黑斑蛙肝脏 CAT对水环境中镉和铅等重金属反应灵敏，可以用其指示低剂量重金属的早期污染。

重金属镉（Cd）是典型的工业毒物和环境污染物，对机体具有多器官和组织毒性。精巢是镉作用的重要靶器官，对生殖功能具有较大的影响。镉能促进活性氧自由基的产生，使机体处于氧化应激状态。镉是环境中普遍存在的、具有代表性的重金属，是一种生物非必需的有毒元素，可在有机体内与生物成分结合为金属络合物或金属螯合物，从而导致酶失活或者使生物活性分子的生理功能受到抑制，从而影响酶的活性、钙和磷的代谢、生长激素的分泌等，并具有明显的致突变、致畸和致癌作用。

3.2.1 镉对黑斑蛙精巢影响

研究者在光镜下观察精巢组织的显微结构变化，结果表明，镉具有毒性效应，可以导致处理后的黑斑蛙精巢组织中的各级生精细胞、支持细胞和间质细胞受到损伤。重金属镉对精巢发育、呼吸及神经系统信号转导等途径均有不良影响，被认为是造成两栖动物种群数量急剧下降的重要原因之一。曹慧等（2012）通过对镉暴露后的黑斑蛙精巢活性氧自由基（ROS）、蛋白质羰基（PCO）以及DNA蛋白质交联等指标的系统分析，研究指出镉诱导机体产生ROS，进而导致蛋白质氧化损伤以及DNA损伤，说明精巢组织ROS的产生是镉致雄性生殖毒害效应机制的重要因素之一。

贾秀英等（2013）研究结果显示，镉可干扰两栖动物精巢组织抗氧化和解毒的能力，从而导致明显的生殖毒效应，黑斑蛙精巢中乙氧基异酚恶唑脱乙基酶、红霉素 N-脱甲基酶和谷胱甘肽转移酶活性的响应可用来评价环境中低水平Cd的污染效应。镉可引起黑斑蛙精子数量减少和精子畸形率增加，且呈剂量-效应关系；亚急性镉暴露对黑斑蛙精巢有明显的毒性作用，其机制与镉致黑斑蛙精巢组织标志酶活力的降低和精巢脂质过氧化作用有关。

3.2.2 镉对黑斑蛙遗传影响

贾秀英等（2011）采用慧星实验检测其精巢细胞 DNA损伤，报道指出ROS水平、MDA含量以及精巢细胞尾长和尾相与镉暴露浓度之间均呈浓度-效应关系。研究者得出镉引起两栖动物黑斑蛙雄性生殖毒性的主要机制是诱导产生自由基并导致脂质过氧化损伤作用增强及DNA损伤。

3.2.2 镉对黑斑蛙肝肾影响

贾秀英等（2006）研究了在不同浓度镉(10～40 mg/L)中暴露30d黑斑蛙脏器组织的亚慢性毒性效应。结果表明，当镉暴露浓度＞30mg/L时，黑斑蛙的肝脏指数显著减少。黑斑蛙肝脏、肾脏和心脏Na+-K+-ATPase活性随着Cd2+浓度的升高而降低，表现出明显的浓度-效应关系。酶活性的变化在一定程度上反映了镉对黑斑蛙的损伤作用。黑斑蛙在较低浓度镉的30d长期暴露下，肝、肾组织脂质过氧化产物MDA含量显著升高，导致机体发生氧化损伤。在镉长期暴露下，细胞膜过氧化增强是镉伤害机体的主要原因，而GSH含量、SOD活性的升高则可能是机体抗过氧化的机理之一。

徐敬明等（2005）研究表明镉在黑斑蛙器官组织的积累具有选择性，主要积累在肠和肝脏中，其次是皮肤、肌肉，而骨骼中没有积累。动物体的肝脏作为重要的解毒器官，使其成为重金属蓄积的重要靶器官，致使镉在黑斑蛙的肝脏得以大量积累。两栖类的皮肤湿润裸露，渗透性强，进行皮肤呼吸，因此对镉的积累作用明显。

贾秀英等（2010）报道黑斑蛙肝脏中镉的积累量、GSH（还原型谷胱甘肽）和MT（金属硫蛋白）含量均随着镉暴露时间的延长而显著升高，具有明显的时间-效应关系。镉可对黑斑蛙肝脏造成氧化损伤，而GSH、MT含量的升高则可能是机体抗氧化损伤的机理之一。研究者指出低浓度镉的长期暴露可引起黑斑蛙肝蛋白质氧化损伤和 DNA损伤，诱导产生大量自由基可能是导致蛋白质和DNA产生损伤的主要机制之一。镉对两栖动物具有蛋白质氧化损伤作用和遗传毒性作用，说明机体中过量的自由基堆积而引起组织蛋白质氧化损伤，可能是镉对黑斑蛙肝蛋白毒理作用的主要机制之一。

铜是生命必需的微量元素，作为氧化还原催化剂或氧的载体参与生物体内多种酶的组成，但超过一定浓度就会产生毒性效应，例如，水中的铜一旦被黑斑蛙蝌蚪的鳃截留，将随血液迅速转移到其他器官中，并主要积累在肝部，当储存超过一定量后，可以使血液中的血红蛋白变性、乳酸脱氢酶等巯基酶活性受抑制，从而对机体产生毒性作用。张曼华（2009）报道铜离子使黑斑蛙蝌蚪红细胞核异常率明显提高，其平均红细胞核异常率达到0.22%。铜离子一定的处理时间和质量浓度下对蛙蝌蚪红细胞有显著的诱突变作用。

铬是动物有机体必需的微量元素之一，对动物新陈代谢等生命活动具有较大的作用，参与动物体内的糖、脂肪和蛋白质的代谢，有降低血糖的作用，如果动物体内铬（Cr6+）含量过高，就会在细胞内还原为Cr3+而构成致癌物质。

铬是许多合金中的重要金属，其化合物在工业生产中可通过多种途径进入环境中，已成为环境污染中毒性最大的重金属之一。生理pH下，铬通常以铬酸盐的形式存在，被吸收后主要富集于肾脏、肝脏等，尤其是肾脏。Cr6+对环境生物具有较强的毒性，可严重影响动物中枢神经、骨骼和眼的分化，引起睾丸萎缩和附睾精子减少、细胞 DNA损伤以及诱发肺癌的发生。王坤英等（2007）结合单细胞凝胶电泳技术，使用12.5umol/L以上的重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液对黑斑蛙外周血细胞具有明显的DNA链断裂损伤诱导效应，重铬酸钾对黑斑蛙胚胎发育的影响不明显，高浓度组重铬酸钾对黑斑蛙蝌蚪的生长发育则具有明显的抑制作用。

汞在自然界主要以金属汞、无机汞和有机汞化合物的形式存在，一般沉积在水体的底质中，一旦进入身体后，Hg2+能与蛋白质、酶类或谷胱甘肽中所含的-SH发生作用，形成牢固的硫醇基，从而使这些酶类的活性受到抑制，破坏细胞的基本功能和代谢，因此，对水生生物的危害和影响极为严重。汪学英等（2001）报道各重金属离子对黑斑蛙胚胎的毒性顺序为： Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Pb2+＞Cr6+，并对其原因进行了初步分析；各重金属离子对蝌蚪期毒性大小依次为 Hg2+＞Cu2+＞Cd2+＞Cr6+＞Pb2+。

锌是污染重金属之一。闫华超等（2007）不同质量浓度的锌离子对黑斑蛙蝌蚪的最终出膜率没有显著影响。锌离子浓度越大，毒性效应越强，致畸率越高。畸变类型主要表现为：尾部呈泡状膨大、尾部呈“S”型、头部呈泡状膨大、个体形态较小。锌处理组黑斑蛙蝌蚪相比对照组死亡率明显增加，而且浓度越高死亡率越高。

硒具有重要营养功能，也是高毒性的非金属元素，过量常会危害动物机体的生理机能，其中以无机硒（如硒化氢、亚硒酸钠等）毒性较大。早期动物实验已证明，过量的硒酸盐和亚硒酸盐能够产生很强的生理毒性和遗传毒性。祝文兴等（2010）研究指出不同质量浓度的硒酸钠（1.25～20 mg/L）和亚硒酸钠（0.25～4 mg/L）染毒处理7d后，黑斑蛙蝌蚪红细胞的微核细胞率，随染毒剂质量浓度的升高呈先增大后减小的趋势，核异常细胞率、总核异常细胞率均随染毒剂质量浓度的升高而增大。亚硒酸钠的毒害作用明显强于硒酸钠，对黑斑蛙蝌蚪红细胞均存在较强的细胞遗传毒性。

四、总结

重金属对黑斑蛙研究内容多限于对LC50、畸形率等的测定或统计，以及对重金属胁迫下抗氧化水平的影响；对实验结果的分析多是描述性的，而从深层次的等位酶角度、基因角度开展实验和分析重金属毒害的研究很少，对体内一些重要物质（如 MT）的代谢及重金属在体内的转运、积累及排出机制等研究较少，黑斑蛙对重金属敏感性不同的机理和不同重金属相互之间的 “协同”或“拮抗”机理的研究有待加强。

参考文献（略）