原种山鸡禽白血病净化技术初探

2018-06-28，，，，，，，，

畜禽业 2018年6期

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(1.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海奉贤 201400； 2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海奉贤 201403)

0 引言

禽白血病(AL)是由反转录病毒科α反转录病毒属的禽白血病病毒(ALV)引起的一种可垂直传播的病毒性肿瘤性疾病。本病在世界各地广泛存在，几乎所有的商品鸡群都存在感染的可能，其病毒(ALV)即可引起感染鸡群免疫抑制、生产性能下降等亚临床致病作用，又能诱发各种急性或慢性的不同红细胞类型的肿瘤。临床上AL主要以成年鸡产生淋巴样肿瘤和产蛋量降低为主要特征，对全世界家禽产业造成严重影响。

我国也不例外，过去20多年，AL给我国各类鸡群造成了严重危害，虽然经过各级兽医防疫部门及相关单位连续多年的检疫净化，目前蛋鸡和白羽肉鸡的AL得到了有效控制，但在黄羽肉鸡和一些地方品种种鸡中，ALV还在继续流行与蔓延，并造成一定程序的危害。为此《国家中长期动病疫病防治规划(2012-2020)》把AL列为必须净化的疫病之一。

1 净化背景

山鸡，学名雉，俗称野鸡，其外观华丽、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，既是一种不可多得的美味佳肴和观赏动物，又是一种具有较高经济价值的珍禽品种。我国是全世界野生山鸡资源最丰富的国家，在目前全世界已知的近30个山鸡亚种中，我国就分布着其中的19个亚种，占所有亚种的近2/3；而且在我国广袤的地域中，除海南和新疆羌塘地区外，遍布着山鸡的踪迹；我国又是世界上最早开始狩猎和利用山鸡的国家之一，考古发现，早在4千多年前的商周时期，我国就有狩猎和利用山鸡的痕迹与记录。但世界上最早开展山鸡规模人工养殖的国家是欧美等发达国家，但他们养殖山鸡的目的主要是满足人们狩猎的需求，特别是美国，像麦克法兰等世界知名山鸡育种公司，在广泛收集世界各地山鸡品种资源后，经数十年的人工选育，成功培育了如七彩山鸡等具有优质高产特性的山鸡品种。

我国在20世纪80年代初期由中国农科院农林特产研究所以资源交换形式引进美国七彩山鸡这一优良品种。进行试养并经小范围推广后，由于七彩山鸡所具有的突出生产性状和优秀经济价值，受到了市场热捧，并由此掀起了国内山鸡人工养殖的热潮，形成了目前规模达亿羽的山鸡人工养殖与销售市场，产生了具大的经济效益和社会效益。

美国七彩山鸡这一优秀山鸡品种在我国刚从美国引入进行规模化人工养殖时，其群体中的ALV检测结果均为阴性，鸡群健康状况良好，生产性能较高。但由于山鸡是ALV的易感群体，因此在经过多个代次的扩繁后，众多群体中先后表现了AL的症状，严重影响了山鸡养殖的生产水平和经济效益。因此，在原种山鸡群中开展AL净化工作，并制定有效的综合防控措施，对防控该病具有尤为迫切的意义。

上海欣灏珍禽育种有限公司目前保有7个品种的山鸡遗传资源，是国家特种经济动物种质遗传资源共享平台唯一的山鸡保种场。为加快国内禽白血病净化进程，推动国内山鸡产业的健康发展，该公司从2015年开始，在山东农业大学和市区二级动物防疫部门的大力支持下，组织开展了原种山鸡AL净化技术的探索，并取得了明显成效。

2 净化方案

在山东农业大学及上海市和奉贤区等市区二级动物疫病预防控制中心等单位的鼎力支持下，公司根据现保有的7个原种山鸡核心种群开产日龄大(200～220日龄)、产蛋周期短(6个月左右)的特点，结合家禽AL净化技术要点，制定了原种山鸡AL净化程序(见表1)。其中注意事项如下。

表1 原种山鸡AL净化程序表

(1)原种山鸡种蛋采用家系孵化，种雏按家系单笼育雏、育成。

(2)孵化、育雏、育成、产蛋种鸡等阶段的鸡舍内环境、免疫、人工授精、公母鉴别、标识佩戴、转群等各环节及各种饲养设施、器具和外环境等必须严格实行生物安全控制措施。

(3)各类疫苗必须严格实行外源病毒检测，免疫时注意注射器针头的消毒，操作人员应按家系更换手套或洗手。

(4)实行全进全出饲养方式。

3 检测技术

3.1 采样

(1)血液样品。按照全群普查或抽样检测的不同比例，采用一次性采样器对原种山鸡核心群种山鸡逐羽或随机采取血液样品1mL，编号待检。

(2)胎粪样品。严格按照生物安全控制要求，对采用家系孵化法孵化的原种山鸡核心群0日龄种雏，按每个家系50%的采样比例，将胎粪挤入盛有1mL PBS液的离心管中，编号待检。

(3)初产蛋清样品。种鸡开产后，选取每羽种母鸡的头3枚初产蛋，采用同一套一次性采样器吸取每枚初产蛋清0.5～1 mL，并移入同一只离心管中，编号待检。

(4)精液样品。初选留种公山鸡，每羽采取精液样品不少于50 μL，移入离心管中，编号待检。

(5)抗凝全血样品。用一次性采样器对P27抗原检测阳性或其他待检种山鸡采取2 mL全血，并快速将采样器中全血沿管壁缓慢注入预置有肝素钠的抗凝管中，编号后须在最短时间内送至实验室作细胞培养和病毒分离。

3.2 检测试剂盒

AL P27抗原检测试剂盒：美国IDXXX公司生产。

3.3 检测方法

3.3.1 AL抗原捕获ELISA检测法

(1)样品处理。①蛋清样品：无需稀释，反复冻融3次以上，取上清液。②胎粪样品：将加有1 mL培养液或样品稀释液的胎粪样品反复冻融3次以上，取上清液。③血清样品：无需稀释，可直接使用。

(2)设置阴阳对照：试剂盒回温，取出包被板，记录加样位置，加入阴阳对照各100 μL，复孔。

(3)加样，孵育：其他孔加入100 μL样品(蛋清或血清、胎粪上清液)，无需稀释；盖板，在18℃～26℃条件下孵育60±5 min。

(4)洗涤，拍干：去离子水洗涤(蛋清使用专用洗液)3～5次，拍干。

(5)加酶标抗体，孵育：每孔加入100 μL酶标抗体，盖板孵育60±5 min。

(6)洗涤，拍干：去离子水洗涤(蛋清使用专用洗液)3～5次，拍干。

(7)加底物、孵育：每孔加入100 μLTMB底物液，盖板孵育15±1 min。

(8)加终止液、酶标仪读数：加入终止液100 μL，酶标仪读数字。

(9)数据分析：使用xchek软件分析结果。

3.3.2 病毒分离法

抗凝全血、精液用此方法检测。

(1)材料准备：DMEM细胞培养液、胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25%)、双抗(100×)、两性霉素、PBS(0.01M)、DF1细胞、肝素钠采血管、细胞培养皿(10CM)、24孔细胞版、吸管、一次性移液管(10 mL)等。

(2)试剂配置：两性霉素试剂、精液稀释液试剂、细胞生长液、细胞维持液等配置，DF1细胞复苏与传代，24孔细胞板制备。

(3)样品处理。①血浆：用肝素钠抗凝管静脉采集1 mL血液，颠倒混匀3次，2 000 rpm离心2 min备用。血浆样品稀释比例为6倍稀释。②公鸡精液：无菌采集公鸡精液50 μL以上，取40 μL加入到160 μL的精液稀释液中，振荡混匀，3000 rpm离心2 min备用。精液样品稀释比例为28～56倍，正常取30倍稀释。

(4)病毒分离。①将处理好的样品100 μL加入到24孔细胞板中，置于培养箱中吸附2～4 h。②完成后倾去上清，在每个孔中加入PBS 0.5 mL，将细胞清洗一遍。③弃去洗液，加入维持液0.5 mL，将24孔细胞板维持生长至第9天进行病毒鉴定。

(5)病毒鉴定。P27抗原测定；间接免疫荧光；测序；斑点杂交。

3.3.3 实验室检测注意事项

(1)把所有的生物材料当作潜在的传染源来处理。

(2)在处理样品时须佩戴防护手套、穿防护服、戴防护眼镜及防护面罩。

4 净化结果

按照预定的净化方案，相关单位通力合作，对公司存栏原种山鸡第四、第五、第六等三个世代核心种群进行了系统的P27抗原检测，并采用严格的净化处置措施，对胎粪检测阳性者淘汰整个家系(含种母鸡和所有种雏)；对血液、蛋清等P27抗原检测阳性个体，采取抗凝全血采用病毒分离法复检；对精液、抗凝全血等采用病毒分离法检测阳性样品直接淘汰阳性个体。相关检测结果见表2。