甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤后相关炎性因子的影响

梁延鸽，牟艳玲

(1.济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南250200；2.山东省医学科学院药物研究所，山东省罕少见病重点实验室，山东 济南250062)

葛花，中药名，具有解酒醒脾，止血保肝之功效，常用于伤酒烦热口渴，头痛头晕，脘腹胀满，吐血，肠风下血等。葛花的主要成分包含葛花苷、尼泊尔鸢尾异黄酮、鸢尾苷等异黄酮[1]。研究指出，葛花苷等成分在体内发挥生物活性的主要原因是因为其可代谢生成尼泊尔鸢尾异黄酮[2,3]。甲胺鸢尾素是葛花苷的代谢形成的新化合物，分子量为357，研究指出，甲胺鸢尾素可有效改善冠状动脉结扎引发的心肌缺血现状，明显提高心肌细胞的存活率[4,5]。本文通过构建异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血损伤模型，探究甲胺鸢尾素对损伤模型大鼠相关炎症因子的影响情况。

1 材料与方法

1.1 动物及药物

12月龄雄性Wistar大鼠，体重250-320 g，由济南大学动物中心提供，许可证号：SYXK(鲁)20090014。甲胺鸢尾素：淡黄色粉末，纯度大于99%，由山东省医学科学院药物研究所药物合成室提供，生产批号：20080901。

1.2 试剂

TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB ELISA试剂盒，上海纪宁生物科技有限公司提供，生产批号分别为：20170109,2017021，20170510,20170408。Bcl-2、NF-κB相关抗体均产美国CST公司，SABC工作液试剂盒为上海瑞齐生物科技有限公司，苏木精、二甲苯、无水乙醇均由济南大学实验室提供。

1.3 仪器

超低温冰箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，全自动生化分析仪(日立)，荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)，组织切片机(德国莱卡)，LEICA-QWIN图像分析系统(德国莱卡)。

1.4 方法

选取雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养一段时间后，随机分成4组(实验1组，实验2组，空白组及模型组)，每组15只，适应性喂养一周后开始灌胃。实验1组给予甲胺鸢尾素大剂量20 mg/(ml·100 g)灌胃、实验2组甲胺鸢尾素小剂量10 mg/(ml·100 g)灌胃、模型组和空白组给予1.0 ml/100 g生理盐水灌胃。连续给药10 d后，并于1 h，各组(空白组除外)均皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素0.4m g/100 g，给药的体积为0.8 ml/100 g，制备异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤模型。

1.4.1血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB的测定

造模成功5 h后，每组大鼠从颈静脉窦取静脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存，根据放免试剂盒的说明测定TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB含量变化。

1.4.2Bcl-2、NF-κB蛋白免疫组化测定

颈静脉取血后，迅速处死动物，取新鲜心脏，在心尖部位病变处沿冠状面取，放入10%的福尔马林中固定，行Bcl-2、NF-κB蛋白免疫组化研究，操作方法按照说明书进行。

2 结果

2.1 甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素损伤大鼠模型血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB的影响

造模后取相应材质检测，各组分别与空白组对比，其中实验1、2组及模型组血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB明显升高(P<0.05)。与模型组对比，实验1、2组血清TNF-α、IL-1β、NF-κB分别明显降低(P<0.05)，其中实验1组比实验2组降低的更加明显(P<0.01)。与模型组对比，实验1、2组血清Bcl-2明显升高(P<0.05)，其中实验1组比实验2组升高更加明显(P<0.01)。(见表1)。

表1 甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素损伤大鼠炎症因子的影响

注：与空白组对比，*P<0.05；与模型组对比，#P<0.05；与实验2组对比，▲P<0.01。

2.2 甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素损伤大鼠Bcl-2蛋白的影响

将各组大鼠进行皮下注射异丙肾上腺素后，与空白组比较，其中模型组大鼠心肌组织中的Bcl-2蛋白升高(P<0.05)，甲胺鸢尾素灌胃的实验组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白明显升高(P<0.01)。(见图1)

2.3 甲胺鸢尾素对异丙肾上腺素损伤大鼠NF-κB蛋白的影响

将各组大鼠进行皮下注射异丙肾上腺素后，与空白组比较，其中模型组、实验1、2组大鼠心肌组织中的NF-κB蛋白升高(P<0.05)，与模型组比较，实验1、2组血清NF-κB蛋白降低(P<0.05)，且实验1组较实验2组降低的更加明显(P<0.01)。(见图2)

注：*P<0.05，**P<0.01。 A：空白组，B：模型组，C：实验2组，D：实验1组

图1大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白水平

注：*P<0.05，**P<0.01。A：空白组，B：模型组，C：实验2组，D：实验1组

图2大鼠心肌组织中NF-κB蛋白水平

3 讨论

异丙肾上腺素，是一种β受体激动剂，临床上常用于支气管哮喘及心脏房室传导阻滞。其药理作用是兴奋心脏β1受体，加快心率，扩张冠脉，增加冠脉流量，过量时可引起心律失常和心肌缺血坏死。采用皮下注射异丙肾上腺素，能够使大鼠的冠脉发生痉挛性收缩，从而提高心肌耗氧量，进而诱发心肌缺血、缺氧、心功能紊乱状态，即缺血再灌注损伤[6]。心肌组织发生缺血再灌注的损伤机制与炎症因子的释放存在密切关系。研究指出，炎症因子例如TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB等，在心肌的缺血再灌注中起到了重要的作用[7-9]。炎症因子引发的炎性反应是导致动脉出现粥样硬化的主要原因，目前临床上治疗冠心病，抗炎干预也是新的研究方向。

心肌细胞的凋亡通路主要为死亡受体通路，死亡受体通路是重要的外源性凋亡通路，目前已知的死亡受体包括：IL-1β、TNF-α、DR3等[10]。TNF-α和IL-1β与受体结合后，可激活caspase-8蛋白并诱导细胞凋亡[11,12]。DR3等在相关受体的结合下，可活化NF-κB诱导细胞凋亡[13,14]。Bcl-2蛋白家族以及NF-κB家族在心肌缺血再灌注损伤中有重要作用，其中Bcl-2蛋白水平表达越高，其抑制细胞凋亡的作用更加显著[15,16]。Bcl-2的过度表达可以阻断线粒体传导通路，起到保护心肌细胞的作用[17,18]。研究发现，下调NF-κB蛋白的表达可以有效减少心肌细胞凋亡情况，有效防止心肌发生缺血再灌注损伤[19]。这说明IL-1β、TNF-α、NF-κ及Bcl-2等因子在心肌缺血再灌注损伤中发挥了重要作用。

本研究酶联免疫结果显示：造模后，实验组、模型组与空白组对比，TNF-α、IL-1β、NF-κB均出现升高现象，这与异丙肾上腺素对心肌细胞的刺激作用有关，但是实验组与模型组相比，TNF-α、IL-1β、NF-κB反而降低(P<0.05)，而且甲胺鸢尾素大剂量组降低效果要比小剂量组更显著(P<0.01)，这说明甲胺鸢尾素能够抑制炎性因子的释放，有效的降低了TNF-α、IL-1β、NF-κB含量。同时本研究还发现，实验组、模型组与空白组相比，Bcl-2含量明显增加(P<0.05)，说明缺血再灌注造成的心肌损伤诱使心肌细胞分泌Bcl-2增多；但是实验组与模型组对比，Bcl-2含量升高更为明显，说明甲胺鸢尾素能够促使心肌细胞分泌Bcl-2参与炎性反应，上调Bcl-2的表达，其中应用大剂量的甲胺鸢尾素作用效果更加明显(P<0.01)，说明了甲胺鸢尾素对心肌损伤有一定的保护作用。免疫组化结果显示，在4个组中，Bcl-2以及NF-κB蛋白的表达结果与ELISA结果一致，说明甲胺鸢尾素可以有效调节Bcl-2及NF-κB蛋白的表达，上调Bcl-2基因，抑制NF-κB蛋白释放，减轻炎症反应，对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。

综上所述，甲胺鸢尾素可以有效减少异丙肾上腺素导致的心肌缺血再灌注损伤，重新调节心脏稳态，调节微血管扩张，改善心肌细胞缺血情况，其调剂机制可能与调节炎症因子的释放来减轻炎症反应，如抑制TNF-α、IL-1β因子的表达，上调Bcl-2蛋白，抑制NF-κB蛋白等有关。后续研究我们将从基因方面展开，详细探究甲胺鸢尾素对缺血再灌注损伤后心肌细胞相关基因表达的干扰作用。

作者简介：梁延鸽(1988-),女，在职研究生，药师，研究方向：心脑血管药理学。

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