Hedgehog信号通路中PTCH1和GLI1蛋白在肝内胆管细胞癌组织中的表达及诊断价值

国麟祺,陈 颖,滕欣丽,夏伟滨,徐 剑,曲义坤*

(佳木斯大学附属第一医院 1.普外二科;2.重症医学科；3.放疗二科，黑龙江 佳木斯154003)

肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma ，ICC)占消化道肿瘤的3%，侵袭性强，恶性程度最高，死亡率高，预后差，近年来发病率逐渐上升[1]。Hh信号通路在胚胎发育过程中起着至关重要的作用，肿瘤中Hh通路的是异常活跃的，在ICC参与了肿瘤细胞的增殖与迁移，Ptch1和GLI1蛋白呈高表达状态[2]。本研究拟检测Ptch1和GLI1蛋白在癌组织中的表达情况，分析其与ICC病理相关性，拟提高诊疗水平，寻找靶向治疗的新途径，改善患者预后。

1 资料与方法

1.1一般资料收集我院2014年1月-6月62例ICC患者的新鲜癌组织和癌旁边缘5 cm处正常组织标本。其中男37例，女25例；年龄29-74岁，平均年龄(54.37±6.52)岁。所有患者术前均未进行治疗，均签署知情同意书，符合医学伦理要求。

1.2主要试剂武汉华美生物工程有限公司生产的一抗兔抗人GLI1抗体，北京万域美澜科技有限公司生产的羊抗人Ptch1抗体，江苏绿叶有限公司生产的免疫组化SP试剂盒。

1.3检测方法[3]患者新鲜癌组织和癌旁正常组织标本，用10%福尔马林固定，经梯度乙醇脱水和二甲苯处理的细胞石蜡包埋切片，脱蜡、水化，PBS洗3次，物理修复，滴加一滴二种抗体在切片上，工作浓度均为1∶200，滴人后置于4℃冰箱过夜，进行HE染色和免疫组化染色。PBS洗三遍，为一抗阴性对照，阳性对照片应用两张试剂公司的阳性片子。

1.4结果判定[4]Ptch1于细胞膜和细胞浆表达，阳性为棕黄色；GLi1细胞浆表达，阳性为深棕黄色。随机5个视野，显微镜下计数1000个细胞，染色细胞超过10%为阳性；染色细胞超过50%为高表达。

1.5统计学处理应用SPSS13.0软件，计数资料采用率(%)表示，采用χ2检验，差异有统计学意义时P<0.05。

2 结果

2.1HE结果癌旁组织见圆形等规则形状，纤维增生少见。癌细胞核浓染，形状杂乱，细胞质淡染或嗜碱性，胆管黏膜下层浸润，胆管壁增厚，向外浸润。

2.2蛋白表达结果Ptch1和GLI1蛋白在ICC组织中均呈高表达，高于癌旁组织(79.03%vs16.13%)(90.32%vs12.90%)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 Ptch1和GLI1的阳性表达情况[n%]

2.3蛋白表达与ICC病理相关性Ptch1和GLI1蛋白的表达与肿瘤TNM分期、是否转移、是否侵润、分化程度以及生存时间有关(P<0.05)。见表2。

3 讨论

肝内胆管细胞癌是指发生在肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，肝门部位最为多见，发生隐匿、发展迅速，严重威胁患者的生命安全。传统手术难以达到根治性切除的肝门区域的肿瘤，复发率与死亡率均居高不下。从基因水平分析ICC发生发展的作用机制，鉴定明确的靶标基因，对ICC进行早期诊断、预防和临床靶向治疗具有重要意义[5]。

表2 蛋白表达与ICC临床病理特征关系%]

Hh信号通路是一条调控胚胎细胞生长分化重要的通路[6]，参与多种器官和组织的发育、血管新生及炎症修复等，可促进上皮细胞转化间质细胞，胚胎停止发育后，相关蛋白被抑制，Hh信号通路关闭，进入失活状态。通路激活是指Ptch跨膜受体与Hedgehog配体结合，激活转录因子GlIl，促进众多基因的转录，如上皮间质转化、染色体形成、肿瘤血管生成等，调节细胞生成、增殖和凋亡[7]。Hh信号通路的异常激活在许多肿瘤中体现，如基底细胞癌(BCC)、横纹肌肉瘤(RMS)、乳腺癌(BC)、宫颈癌(CC)、前列腺癌(PCa)、髓母细胞瘤(MB)、胃癌(SC)、肝癌(HCC)、肺癌(LC)、食道癌(EC)。

胆管癌的发生、发展与Hh信号通路异常激活有关，ICC7种细胞系均表达Ptch1，还有多数细胞系表达GLI1[8]，Hh信号的目的基因是Ptch1，Ptch1是受体也是重要的负反馈调节因子；GLI1作为重要的转录因子，起着重要的不可替代的调控作用，Ptch1与GLI1两种蛋白表达水平反映了Hh信号通路的活化水平[9]，二者的表达水平增高提示Hh信号通路的活化水平显著增高，在恶性肿瘤中都存在Hh信号通路异常激活，以及Ptch1与GLI1的过度表达[10]。其作用机制为GLI1诱导Bcl-2因子的表达以抑制其凋亡，或者诱导G0/S期细胞表达以促进其增殖；GLI1促进上皮组织向间质细胞转化的细胞因子活化，引起癌细胞转移淋巴、血液，促进肿瘤向远处侵袭[11]。

本研究发现，在ICC组织中Ptch1和GLI1的表达率均显著高于癌旁组织(79.03%vs16.13%)(90.32%vs12.90%)，提示ICC的发生、发展与二者的高表达有关，与过高的Hh信号通路活化水平有关。二者的表达与肿瘤分化程度、手术方式、转移状况、TNM分期以及生存时间均具有相关性，根治性治疗的两种蛋白表达率要低于姑息性手术患者，二者蛋白表达率越高，肿瘤TNM分期越高，分化水平越低，肿瘤向远处侵袭能力越强，生物学行为更差，生存期更短[12]。说明Hh信号通路异常激活，Ptch1调控GLI1的高表达，促进肿瘤细胞的生成、增殖、侵袭，高活化水平的Hh信号通路在ICC的发生发展中起着不可缺少的调控作用。

综上所述，Hh信号通路的异常激活促进肿瘤细胞的增殖与迁移，Ptch1蛋白与GLI1蛋白过表达提示预后不良，检测二者表达结果可有效评估患者的预后，通过特异性阻断Hh信号传递有望成为胆管癌治疗的新靶点。

作者简介：国麟祺(1982-)，男，主治医师，研究生学历，主要从事微创外科科研及临床工作。

参考文献：

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[7]郭丽梅，杜 娟，廖 鹰，等.Hedgehog信号通路转录因子Glil蛋白在结直肠癌组织中的表达[J].资料基础与临床，2016，29(1)：1.

[8]龙 冰，张祥忠，李旭东，等.GLI1在成人急性淋巴细胞白血病中的表达及意义[J].中国实验血液学杂志,2015,23(4)：946.

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[10]许尚虞，杨 涛，林中啸，等.Glil在髓母细胞瘤中的表达及其靶向抑制的研究[J].中国医药导报，2016，13(23)：8.

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[12]姚 利，聂国辉，蔡 智，等.Hedgehog信号通路中下游转录因子GLI1在鼻咽癌中的表达[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2016，24(5)：321.