阿魏酸抑制A549肺癌移植瘤生长及其机制研究

吴竞 王廷祥 魏楠 吴秀绍 刘杏娥

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因[1]。尽管目前多种治疗策略和抗癌药物的使用提高了治疗效果，但是肺癌患者的5年生存率仍然很低[2]。中药被用来治疗人类疾病已有几百年的历史。近年来，随着联合化疗药物的应用，中药在肿瘤的治疗中起着增强化疗效果、减轻患者疼痛、延长患者生存时间等作用[3]。阿魏酸是从伞形科阿魏根茎中提取的一种中药单体，目前已经发现其在结肠癌、肺癌和乳腺癌中具有抗肿瘤活性[4-6]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞生长、增殖和凋亡过程中起着重要的作用。肿瘤的生长与肿瘤细胞增殖、凋亡密切相关，增殖蛋白Ki-67和凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）被广泛用来检测肿瘤生长过程中细胞增殖凋亡的影响。但是阿魏酸是否具有抑制肺癌生长的作用及其可能的机制尚未明确。本研究拟通过用阿魏酸干预肺癌动物模型，探究阿魏酸对肺癌移植瘤的影响，为临床治疗肺癌提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验试剂 阿魏酸购自上海中医药研究所；A549细胞购自美国ATCC细胞库；TUNEL试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；引物购自广州锐博生物技术有限公司；mTOR、Ki-67、Caspase-3 和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗购自美国Sigma公司；双氧水和柠檬酸钠抗原修复液购自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；DAB显色盒购自北京中杉金桥有限公司。

1.2 实验动物 6周龄BALB/c雄性裸鼠40只，SPF级，体重约（20±3）g，购自上海史莱克实验动物有限公司，动物合格证编号：SCXK（沪）2012-0002。本实验研究方案通过医院伦理委员会批准。

1.3 细胞处理 将A549细胞加入含10%FBS的DMEM培养液中，37℃、5%CO2条件下进行培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.4 裸鼠移植瘤模型构建 取对数生长期的A549细胞，配置成1×107/ml，向裸鼠右侧腋窝皮下注射100μl（1×106个细胞）细胞悬液。在注射期间和注射后观察注射部位有无包块出现，保证无破溃区，无菌条件下饲养，建立裸鼠肺癌移植瘤模型。本研究40只裸鼠全部成瘤，成瘤率100.00%。

1.5 分组及给药方法 采用随机数字表法将模型裸鼠分为模型对照组、阿魏酸25mg/L组、阿魏酸50mg/L组和阿魏酸100mg/L组4组，每组10只。各组给药方法：（1）模型对照组：腹腔注射0.2ml的 0.9%氯化钠溶液；（2）阿魏酸25mg/L组：腹腔注射由25mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化钠溶液配置的25mg/L阿魏酸溶液0.2ml；（3）阿魏酸50mg/L组：腹腔注射由50mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化钠溶液配置的50mg/L阿魏酸溶液0.2ml；（4）阿魏酸 100mg/L组：腹腔注射由 100mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化钠溶液配置的100mg/L阿魏酸溶液0.2ml。各组每天给药1次，连续3周。

1.6 移植瘤的处理 3周后脱臼处死裸鼠，记录裸鼠瘤体质量、移植瘤的长径和短径，肿瘤体积计算方式：体积=（长径×短径2）/2。计算肿瘤的抑瘤率来比较各组裸鼠瘤体质量的差异性变化，抑瘤率=（1-实验组平均瘤质量/模型对照组平均瘤质量）×100%。然后将肿瘤组织冻存于液氮中进行后续实验。

1.7 qRT-PCR定量检测mTOR mRNA表达水平 将移植瘤组织剪碎后加1ml Trizol提取组织总RNA，分光光度计测定RNA浓度，进行反转录成cDNA。以cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。以U6为内参，设计引物。mTOR上游：5′-GAACCTCAGGGCAAGATGCT-3′，下游：5′-CTGGTTTCCTCATTCCGGCT-3′。PCR 反应条件：94℃预变性 5min，95℃变性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，扩增 40 个循环。采用2-ΔΔCT法进行结果分析。

1.8 Western blot法检测 mTOR、Ki-67、Caspase-3 蛋白表达水平 将肿瘤组织剪碎后放入液氮进行研磨，加入500μl蛋白裂解液继续研磨，离心去上清液，用蛋白定量法（BCA法）检测蛋白浓度。取40μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳结束后将其转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室温下用5%的脱脂奶粉封闭30min，加入mTOR、Ki-67、Caspase-3一抗置于4℃孵育过夜，等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液（TBST）洗膜后加入兔二抗于室温下孵育2h，TBST洗膜后用ECL化学发光液进行化学发光反应并曝光。以GAPDH为内参照，用Quantity One软件对条带灰度值进行测量并分析。

1.9 免疫组化法检测组织中mTOR、Ki-67、Caspase-3蛋白表达水平 将肿瘤组织进行固定并常规石蜡包埋，进行连续切片，切片厚度约4μm。切片脱蜡至水，用柠檬酸钠进行抗原修复，用3%双氧水灭活内源性氧化酶，加入 mTOR、Ki-67、Caspase-3 一抗（1：100）孵育后，加入二抗继续孵育，用DAB溶液进行显色，苏木素复染后封片。视野下棕黄色颗粒为阳性结果，观察蛋白在肿瘤组织中的表达情况。棕黄色颗粒越多，表示蛋白表达水平越高。

1.10 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。每个实验均重复3次。

2 结果

2.1 阿魏酸对肺癌肿瘤组织生长的影响 模型对照组裸鼠移植瘤的体质量为（0.64±0.05）g；阿魏酸25mg/L组裸鼠移植瘤的体质量为（0.43±0.03）g，抑瘤率为32.82%；阿魏酸50mg/L裸鼠移植瘤的体质量为（0.36±0.04）g，抑瘤率为43.75%；阿魏酸100mg/L裸鼠移植瘤的体质量为（0.24±0.03）g，抑瘤率高达62.51%；不同剂量的阿魏酸组与模型对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1a。另外，检测肺癌移植瘤的体积发现，模型对照组裸鼠移植瘤体积为（0.98±0.11）cm3，不同剂量的阿魏酸组肺癌移植瘤生长也受到显著的抑制，分别为（0.57±0.03）、（0.43±0.04）、（0.31±0.05）cm3，与模型对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），呈现剂量效应关系，见图1b。

图1 阿魏酸抑制瘤体质量和体积（a：移植瘤体质量；b：移植瘤体积；与模型对照组相比，*P＜0.05）

2.2 阿魏酸对肺癌移植瘤组织mTOR的mRNA和蛋白表达水平的影响 与模型对照组比较，不同剂量的阿魏酸组mTOR的mRNA和蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），并具有剂量依赖性，见图2。

图2 阿魏酸抑制瘤体质量和体积（a：移植瘤体质量；b：移植瘤体积；c：各组肺癌移植瘤组织mTOR蛋白表达水平；与模型对照组相比，*P＜0.05）

2.3 阿魏酸对肺癌移植瘤组织中Ki-67、Caspase-3蛋白表达的影响 与模型对照组比较，不同剂量的阿魏酸组处理移植瘤后，A549细胞的Ki-67蛋白表达水平均降低（均P＜0.05），并且随着阿魏酸的剂量升高而降低；而Caspase-3蛋白表达水平均升高（均P＜0.05），亦具有剂量依赖性，见图3。

图3 阿魏酸对肺癌移植瘤组织中Ki-67、Caspase-3蛋白表达的影响（a：各组肺癌移植瘤组织Ki-67和Caspase-3蛋白表达电泳图；b：各组肺癌移植瘤组织Ki-67和Caspase-3蛋白表达水平；与模型对照组相比，*P＜0.05）

2.4 免疫组化检测肺癌移植瘤mTOR、Ki-67和Caspase-3蛋白表达水平 免疫组化结果显示阿魏酸能抑制移植瘤组织中mTOR蛋白表达，并随阿魏酸剂量升高移植瘤组织中mTOR蛋白表达水平降低更明显。免疫组化结果亦显示阿魏酸能抑制Ki-67蛋白表达，促进Caspase-3蛋白表达升高，见图4（插页）。

3 讨论

我国作为传统的中医药大国，中草药资源丰富且易于获得，因此，寻找合适的中药防治肺癌不仅有助于完善肺癌的治疗方案，减少肺癌患者的病死率，提高肺癌患者近期和远期存活率，也可以作为肺癌姑息治疗中的一种选择，对治疗肺癌具有重要意义。

阿魏酸作为一种芳香族化合物，大量存在于植物的细胞壁中。阿魏酸具有抗氧化、抗微生物、抗血小板、抗炎、抗高血脂和抗癌等多种生物活性[7]。Fong等[8]报道阿魏酸能通过增加肿瘤细胞内源性活性氧生成抑制肺癌细胞的增殖和迁移。Nasr等[9]发现阿魏酸能通过抑制肺癌肿瘤细胞的粘连和迁移延缓肿瘤的进展。本研究通过检测各组小鼠中肺癌移植瘤的体质量和体积，发现阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生长，并且100mg/L的阿魏酸抑瘤率高达62.51%。

已有研究报道mTOR蛋白的异常表达影响多种癌症组织的生长和凋亡，比如肺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌[10]。Jin等[11]报道抑制mTOR蛋白表达能抑制肺癌增殖并促进肺癌的凋亡。本研究中qRT-PCR、Western blot和免疫组化结果均显示阿魏酸干预后，肺癌移植瘤组织中mTOR表达受到抑制，说明阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤组织中的mTOR表达，这可能是其发挥抑制肺癌移植瘤生长的一种机制。

Ki-67作为细胞增殖蛋白，其在肿瘤的发生、发展中有重要作用。Antonarakis等[12]研究表明Ki-67的表达增加与肿瘤的增殖和侵袭密切相关。Ji等[13]报道Ki-67的高表达与肺癌肿瘤组织的高增殖活性、低分化和早期侵袭转移有关，并对肺癌患者的预后具有一定预测意义。Caspase-3作为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成员之一，在组织细胞凋亡过程中表达水平显著增加[14]。本研究Western blot和免疫组化结果均显示不同剂量的阿魏酸干预后，肺癌移植瘤组织中Ki-67表达下降，Caspase-3表达升高，说明阿魏酸抑制肺癌移植瘤增殖蛋白Ki-67表达和促进凋亡蛋白Caspase-3表达，导致肿瘤增殖受到抑制并促进肿瘤凋亡。

综上所述，本研究发现阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生长，其机制可能是通过下调mTOR蛋白表达，抑制增殖蛋白Ki-67表达和促进凋亡蛋白Caspase-3表达。之后笔者将通过细胞实验进一步探索mTOR通路在阿魏酸抑制肺癌细胞增殖中的作用。

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