维生素D受体基因启动子甲基化异常与婴儿尿路感染相关性研究

杨建环 王德选 陈敏广 胡小涵

尿路感染是婴幼儿时期最常见的发热性疾病之一，约2%的男孩和8%的女孩在6岁内曾患过急性尿路感染，反复的尿路感染可引起肾瘢痕形成、高血压、肾功能不全等[1]。维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）是核受体超家族成员之一，在哺乳动物中几乎所有组织均表达VDR[2]。维生素D3/VDR信号涉及机体的矿物质代谢和骨稳态，调节机体的生长发育，并在癌症预防及调节免疫功能等方面发挥重要作用[3-4]。

DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，而DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）参与了DNA甲基化过程[5]。基因启动子区域和增强子区域CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与DNA相结合，从而抑制基因的转录；而特定基因的低甲基化可导致该基因呈过度表达状态，从而参与疾病的发生和发展过程[6]。研究表明VDR基因启动子甲基化异常可能与某些疾病的发生相关，如乳腺癌患者的VDR基因启动子甲基化异常可能与化疗耐药相关[7]。然而目前国内外有关VDR基因启动子甲基化异常与婴儿尿路感染的相关性研究尚少，因此本研究旨在探讨尿路感染婴儿VDR基因表达变化，同时研究DNA甲基化异常对VDR基因表达的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2015年8月至2016年2月在本院儿童肾内科住院的急性尿路感染患儿32例（尿路感染组），年龄1～12个月。入选标准：（1）初发的发热性尿路感染；（2）主要临床症状为发热、喂养困难、呕吐、尿液浑浊、尿臭、排尿哭吵不安、精神萎靡等；（3）白细胞尿或脓尿；（4）肾静态核素显像提示肾盂肾炎。排除标准：（1）合并肾脏或泌尿道先天性畸形的婴儿；（2）合并尿路结石。选择同期本院门诊健康体检婴儿30例作为健康对照组，年龄1～12个月。本研究获得医院伦理委员会批准和患儿家属知情同意。

1.2 VDR、DNMTs mRNA表达水平检测 采用荧光定量PCR法。先用Trizol法提取外周血单个核细胞的总mRNA，逆转录成 cDNA（PrimeScript RT reagent Kit，大连宝生物工程有限公司）。再用SYBR Green荧光定量PCR法检测mRNA的表达水平[FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），罗氏（Roche）生物公司]，反应条件：95℃预变性5min，然后95℃变性 10s，60℃退火 20s、72℃延伸 20s，共 40 个循环。结果以 2-ΔCT相对定量表示，所有样本均设置复孔。引物合成由上海生工生物有限公司完成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3 重亚硫酸氢钠测序技术（BSP）检测VDR基因启动子的甲基化水平 提取样本的全血基因组DNA 1ng～2μg，血液基因组DNA提取试剂盒购置天根生化科技（北京）有限公司，操作过程参考说明书。经亚硫酸氢钠处理后[EpiTect bisulfite kit试剂盒，凯杰生物技术（上海）有限公司，操作过程参考说明书]，DNA序列中非甲基化的脱氧胞嘧啶（C）均被亚硫酸氢钠转变为脱氧尿嘧啶（U），而甲基化状态下脱氧胞嘧啶（C）不会被亚硫酸氢钠转变。将亚硫酸氢钠处理后的基因组DNA送检上海生工生物有限公司进行BSP分析。尿路感染组和健康对照组各送检12例样本，每例样本检测5个克隆。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组VDR mRNA表达水平比较 尿路感染组患儿VDR mRNA表达水平为0.096±0.015，高于健康对照组婴儿的0.046±0.009，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图 1。

图1 两组VDR mRNA表达水平比较

2.2 两组DNMTs mRNA表达水平比较 尿路感染组患儿DNMT1 mRNA表达水平为0.034±0.006，低于健康对照组婴儿的0.057±0.009，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。尿路感染组患儿 DNMT3a mRNA表达水平为0.056±0.009，健康对照组婴儿为0.072±0.010，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。尿路感染组患儿DNMT3b mRNA表达水平为0.038±0.005，低于健康对照组婴儿的 0.045±0.007，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

2.3 两组VDR基因甲基化水平比较 BSP检测结果显示，VDR基因片段中共含有13个CpG位点。12例尿路感染组患儿VDR基因启动子的甲基化水平为（0.00±0.00）%，而健康对照组婴儿VDR基因启动子的甲基化水平为（5.31±8.19）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示尿路感染患儿的VDR基因启动子呈低甲基化状态，见图5。

图2 两组DNMT1 mRNA表达水平比较

图3 两组DNMT3a mRNA表达水平比较

图4 两组DNMT3b mRNA表达水平比较

图5 两组VDR基因甲基化水平比较

3 讨论

VDR是介导维生素D发挥生物学效应的细胞内生物大分子，属于甲状腺激素受体和类固醇激素受体的超家族成员。既往研究发现维生素D缺乏与婴儿尿路感染相关[8]，本研究探讨了VDR与婴儿尿路感染的关系，结果提示尿路感染患儿VDR mRNA表达水平升高。这可能与机体通过提高VDR的表达水平，来增强维生素D与VDR的结合，从而弥补尿路感染患儿维生素D不足所带来的效应。

为进一步探讨尿路感染患儿VDR mRNA表达增高的机制，笔者进一步研究了DNA甲基化对VDR基因启动子的调控作用。笔者采用BSP检测VDR启动子的甲基化水平，发现12例尿路感染组患儿VDR基因启动子为完全低甲基化，甲基化水平为（0.00±0.00）%；而健康对照组婴儿VDR基因启动子甲基化水平为（5.31±8.19）%。因此尿路感染患儿VDR基因启动子呈低甲基化状态，导致VDR mRNA表达水平增高，从而影响维生素D与VDR的结合。由此推测尿路感染患儿的VDR基因表达受DNA甲基化水平的影响，DNA低甲基化水平促进VDR基因的表达。

DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸的5′侧胞嘧啶上，而绝大多数CpG位点在细胞的整个生命周期中保持着甲基化状态[9]。CpG岛的位置主要处于基因启动子区域，且CpG岛的甲基化可直接导致相关基因发生转录沉默[10]。既往研究表明VDR基因甲基化异常可能与某些疾病的发生相关，例如乳腺癌患者的VDR基因甲基化异常可能与化疗耐药相关[7]。本研究发现VDR基因甲基化异常与婴儿尿路感染相关。

DNMTs是催化DNA甲基化的主要反应酶，包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3L，它们之间相互协调，共同维持基因组DNA的甲基化稳定[11]。在正常成人组织中，DNMT1呈持续性低表达状态，DNMT3a与DNMT3b呈失表达或低表达状态；而在癌细胞中DNMTs呈过度表达。研究发现在子宫内膜样腺癌中，DNMT1、DNMT3b的表达水平比正常组织升高2～4倍[12]。本研究对DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平进行检测，发现尿路感染患儿的DNMT1 mRNA表达水平降低，而DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平无明显差异，提示DNMT1表达水平降低可能与尿路感染患儿VDR基因启动子的低甲基化水平相关。

综上所述，笔者推测尿路感染患儿DNMT1表达水平降低导致VDR基因启动子的低甲基化水平，从而引起VDR mRNA表达水平升高。本研究从表观遗传学水平上探讨了VDR基因表达调控的可能机制，为今后深入研究表观遗传学与VDR基因表达的关系提供理论基础。由于本研究是基于临床的病例对照分析，可能存在样本偏差，今后需要更大的临床样本数及分子生物学实验来验证。

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