基于DNA条形码对南极Yelcho站周边海域鱼类的种类鉴定

李渊 张然 宋普庆 李海 陈坚 林龙山

(国家海洋局第三海洋研究所, 福建 厦门 361005)

0 引言

南大洋具有独特的海洋生态环境, 常年低温、海冰漂浮、初级生产力波动剧烈等是其主要的特征, 而南极鱼类则是该海域具有代表性的种类之一, 在食物网中具有重要的位置, 在经历了显著的辐射进化后已适应了南极大尺度极端的生态系统[1]。南极鱼类大部分为具有区域性特征的底栖鱼类, 主要隶属于鲈形目(Perciform)、南极鱼亚目(suborder Notothenioidei), 其中常见的5个科为阿氏龙科(Artedidraconidae)、渊龙科(Bathydraconidae)、冰鱼科(Channichthyidae)、裸南极鱼科(Harpagiferidae)和南极鱼科(Nototheniidae),而南极鱼科种类占南极海域鱼类种类的70%以上,生物量占91%以上[2]。

以线粒体COI基因部分序列作为DNA条形码, 该技术一经提出就被广泛应用[3], 因为它实现了物种鉴定的标准化, 不再完全依赖于样品的完整性和鉴定者的经验[4-5], 如今该标记在物种鉴定方面的优势越来越明显。在物种间的条形码比较方面, 同种内的差异较小, 而种间的差异显著, 同时该标记还被成功用于隐存多样性发掘[6-7]、新纪录种或新种的发现[8-9]及鱼类浮游生物鉴定等方面的研究[2,5,10]。

Yelcho站(64°62′S, 63°35′W)是智利南极度夏科考站, 位于帕默群岛(Palmer Islands), 有关该站周边海域海洋生物的研究较少, 仅见智利南极研究所(Chilean Antarctic Institute, INACH)内部研究报道, 而南极不同海域鱼类的地域性较强, 种类组成差异较大, 因此, 有必要采用DNA条形码技术对该海域的鱼类样品进行准确的种类鉴定,积累南极鱼类分子遗传学信息, 也为今后不同海域南极鱼类的比较研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与鉴定

基于中国第32次南极科学考察暨中智第2次联合南极半岛综合科学考察, 于2016年2月在帕默群岛Yelcho站周边海域, 利用地笼网捕获8尾南极鱼类成鱼。依据Fischer和Hureau[11]的分类标准对所有鱼类样品进行形态学鉴定, 并对其进行编号,测量其体长和体重, 体长范围为234—309 mm, 体重范围为155.2—332.1 g。所有南极鱼类中文名称参考《拉汉世界鱼类系统名典》[12]。所有样品带回实验室进行后续研究, 目前样品保存在国家海洋局第三海洋研究所海洋生物与生态实验室。

1.2 实验方法

用剪刀剪取南极鱼类适量背部肌肉组织进行酒精固定, 采用DNA提取试剂盒提取总基因组DNA, 4℃保存备用。用于扩增COI片段的引物为[3]:F1: 5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′;R1: 5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。PCR反应体系为25 mL[13]: 0.15 μLTaqDNA聚合酶, 2.5 μL dNTP(2 mmol•L–1), 2 μL 10×Taq buffer(含Mg2+), 正反引物各1 μL(2 mmol•L–1), DNA模板1 μL, 其余dd H2O补足。反应条件为: 95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环; 72℃延伸10 min。对符合测序要求的纯化PCR产物送生物有限公司进行双向测序。

结合形态学的鉴定结果, 下载GenBank中革首南极鱼(Notothenia coriiceps)、花纹南极鱼(Notothenia rossii)、乔奇裸南极鱼(Harpagifer georgianus)和伯氏肩孔南极鱼(Trematomus bernacchii)的同源序列用于分子遗传学比较分析(表1)。

表1 研究所用南极鱼类样品和序列信息Table1. Information of Antarctic fishes’ samples and investigated sequences

1.3 数据处理

对测得的原始序列进行比对及校正, 获得目的片段用于后续分析。将所有序列在NCBI数据库中进行BLAST序列相似性比对, 采用两两序列间遗传相似度＞98%的为同一物种, 92%—98%为同一属, 85%—91%为同一科的标准对采集的南极鱼类进行比对和种类鉴定, 选取最佳匹配值(the best match)和种间最佳匹配值(interspecific best match)[5-6]。选取2%为种间的遗传分化界限, 对所有比对结果划分为3种模式[5,10]。模式Ⅰ是鉴定到种(match to species): 最佳比对值(the best match)低于遗传分化界限, 最佳邻接比对值(the nearest neighbor best match)高于遗传分化界限, 该模式下能鉴定到种; 模式Ⅱ是模糊种(uncertain match):最佳比对值和最佳邻接比对值均低于遗传分化界限, 该模式下鉴定到的种是不确定的或者错误的;模式Ⅲ是无法匹配种(unmatched): 最佳比对值和最佳邻接比对值均高于遗传分化界限, 该模式下由于条形码参考数据库(reference library)的限制导致物种无法鉴定。基于K2P模型利用Mega 4.0软件计算各物种间的变异位点、简约信息为点、种内遗传距离、种间遗传距离、条形码间隙(barcoding gap)等参数, 并构建邻接关系树[14-15]。

2 结果

2.1 分子多态性

经形态学鉴定后, 发现8尾南极鱼类中存在3个种, 分别为革首南极鱼(Notothenia coriiceps)、伯氏肩孔南极鱼(Trematomus ber-nacchii)和乔奇裸南极鱼(Harpagifer georgianus)(表1)。为了进一步确认形态鉴定结果的准确性,利用COI基因片段通用引物对8尾南极鱼类进行扩增并双向测序, 去除引物得到目的片段长度655 bp, 结合GenBank中的同源序列最终截取608 bp用于后续分析。8尾样品中保守位点484个, 变异位点124个(图1), 简约信息位点123, 单一信息位点1个, 无插入/缺失位点。A+T碱基含量(53.5%)明显高于G+C碱基含量(46.5%)(图2)。

图1 8尾南极鱼类部分COI基因序列的变异位点Fig.1. Variable sites of partly sequences of COI gene among eight Antarctic fishes

图2 8尾南极鱼类部分COI基因序列的碱基组成比例Fig.2. Percentage of base composition of partly sequences of COI gene among eight Antarctic fishes

对所有8条目的序列进行相似性比对发现,序列相似度(最佳匹配值)均在98%以上, 为了检测比对结果的准确性, 同时对每一个体的种间最佳匹配值进行统计。以相似度98%作为同一物种的界限(2%为种间的遗传分化界限)对所有个体进行分析, 结果显示有2个个体属于模式Ⅰ(25%),能准确鉴定到种; 有6个个体属于模式Ⅱ(75%),属于模糊种, 个体Y2、Y3、Y5—Y8对应两种相似度在99%以上的物种(N. coriiceps和N. rossii);没有个体出现在模式Ⅲ中(图3)。

图3 每个个体最佳匹配值和种间最佳匹配值之间的比较, 黑色线代表物种间分化的界限. Ⅰ-鉴定到种;Ⅱ-模糊种; Ⅲ-无法匹配种)Fig.3. Best match compared with nearest neighbor (similarity percentage) for each specimen. Dotted lines correspond to 2% divergence threshold for species boundaries. Ⅰ- match to species, Ⅱ- ambiguous species, Ⅲ- unmatched species

2.2 遗传结构

结合GenBank中下载的同源序列构建NJ系统发育树, 结果显示所有序列明显分为4个组群,其中组群1有9条序列组成, 组群2、组群3和组群4均有3条序列组成(图4)。结合形态学鉴定结果可以发现, 组群1为革首南极鱼, 但其中KF412866是以N. rossii(花纹南极鱼)为学名提交;组群2为花纹南极鱼, 但KF412867是以N.coriiceps(革首南极鱼)为学名提交; 组群3为乔奇裸南极鱼, 其中HQ713152以Harpagifersp.学为名提交; 组群4为伯氏肩孔南极鱼。

2.3 DNA条形码间隙

基于核苷酸最佳替换模型K2P模型, 分别计算4个组群间和组群内的遗传距离(表2), 结果显示各种间的遗传距离范围为0.039—0.176, 均高于2%的种间遗传分化界限, 明显为4个有效种;各组群内的遗传距离范围为0—0.004, 均低于2%的种间的遗传分化界限, 明显属于种内差异。种间遗传距离和种内遗传距离基本符合种属间的“10倍法则”[16]。4种南极鱼类的最大种内遗传距均低于该物种的最小种间遗传距离, 图5显示种间和种内的遗传距离间存在明显的间隙, 即DNA条形码间隙, 进一步证实各物种的有效性。

图4 基于所有个体构建邻接关系树. 鱼类图片引自文献[11]Fig.4. Neighbor-joining tree for all fish individuals based on COI sequences. Pictures of Antarctic fishes cited from reference [11]

表2 4个组群基于COI基因序列的组内(对角线)和组间(下三角)的遗传距离Table 2. Genetic distances of COI within (on the diagonal)and among (below the diagonal) four groups

3 讨论

南极鱼类不同海域间物种组成差异显著[1-2],尤其在雪龙号科考船无法到达的Yelcho站海域采集的鱼类样品更显得弥足珍贵, 因此有必要对采集到的鱼类样品进行准确物种鉴定, 为后续的研究提供科学参考。

图5 基于K2P模型计算各物种的DNA条形码间隙. 种间遗传距离的最大值和最小值分别用上下横杠进行表示, 中间横杠为中位值; 蓝线代表最大种内遗传距离; 红线代表平均种内遗传距离Fig.5. DNA barcoding gaps for all of the species based on the K2P model. Median interspecific distances with maximum and minimum values are represented by the upper and lower bars, respectively; Blue line:Maximum intraspecific distance; Red line: Mean intraspecific distance

由序列相似性比对结果看出, 8尾鱼中仅2尾能准确鉴定到种, 有6尾属于模糊种。为了进一步确认物种的准确性, 本研究结合GenBank中的同源序列进行系统发育分析发现, 所有序列明显分为4个组群, 其中8尾样品明显分为3个组群。结合形态学鉴定结果可以确定组群1为革首南极鱼,组群2为花纹南极鱼, 组群3为乔奇裸南极鱼, 组群4为伯氏肩孔南极鱼。由系统发育树中可以看出KF412866和KF412867均以错误的学名进行提交, 但笔者认为造成这种错误的原因是序列提交者在序列提交时混淆了序列编号, 而非最初将两种鱼类进行错误鉴定, 毕竟这两种鱼类在胸鳍鳍条数上差异明显(革首南极鱼16—17 VS 花纹南极鱼21—24)。Harpagifersp.(HQ713152)实际为乔奇裸南极鱼。由此可以看出本研究不但对条形码参考数据库中的错误序列进行纠正, 还能对以前研究中的未定种类进行种类鉴定。4个组群间的遗传距离明显高于种间遗传分化界限, 而各物种的种内遗传距离均低于种间的遗传分化界限, 基本符合种属间的“10倍法则”[16], 且各物种内均存在明显的DNA条形码间隙, 进一步验证了各物种的有效性。

综合上述结果可以看出, 以COI基因片段作为DNA条形码与形态学相结合可成功用于南极海域鱼类物种准确鉴定, 8尾样品内存在3个有效种, 其中组群1可以作为革首南极鱼鉴别的DNA条形码,组群3可以作为乔奇裸南极鱼鉴别的DNA条形码,组群4可以作为伯氏肩孔南极鱼鉴别的DNA条形码; 获取的样品中有7尾南极鱼科鱼类, 1尾裸南极鱼科鱼类, 该结果也在一定程度上反映出Yelcho站周边海域在物种组成和数量分布方面均以南极鱼科鱼类为主[2]。

因此, 将传统的形态学和分子遗传学相结合对物种进行分类才能确保物种鉴定的准确性, 正确的形态鉴定能保证条形码参考数据库的准确性,准确的条形码又能指导后续的物种鉴定[5], 二者相辅相成, 形成良好的物种鉴定循环, 有助于今后的种类鉴定、隐存种的发现、多样性调查及系统发育等研究。

4 结论

利用形态学和DNA条形码技术能成功鉴定出Yelcho站附近海域采集到的8尾鱼类样品, 3种鱼类的种内和种间遗传界限明显, 基本符合种属间的“10倍法则”, 且各物种内均存在明显的DNA条形码间隙, 其中南极鱼科鱼类有7尾, 在一定程度上反映出Yelcho站周边海域鱼类在物种组成和生物量上均以南极鱼科鱼类为主。

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