胡椒醛-罗丹明B衍生物荧光探针的合成及其对Cu2+的识别

贾治芳,王科伟,刘慧君,郭 永,冯 锋*

(山西大同大学化学与化工学院,山西大同7009)

通过人工合成受体来识别环境和生物体内的过渡金属离子是当今科学研究的热点之一[1]。铜作为植物和动物生命活动中必需的微量元素，含量过量则会危害健康甚至导致死亡。同时，铜的富集也会造成严重的环境污染，因此识别生命体和环境中的Cu含量具有重要的现实意义[2]。与传统的铜离子识别方法(荧光光谱法、分光光度法[3]和原子吸收法[4])相比，荧光探针法[5]具有快速、操作简单和低检测限、高选择性等优势，已被广泛应用于铜离子的识别。

罗丹明类荧光染料由于具有高摩尔消光系数、高光稳定性、高荧光量子产率、较长的激发和发射波长等优异的光物理和光化学性能，是制备荧光探针的理想材料之一[6]。由于Cu2+为顺磁性离子，具有极强的荧光猝灭能力，因此报道的大多数二价铜离子荧光探针为荧光猝灭型，而荧光增强型的Cu2+荧光探针则具有更好的应用价值[7]。本文通过简单的2步反应合成了未曾报道过的胡椒醛-罗丹明B衍生物荧光探针（结构见图1），并将其应用于Cu2+的识别性能研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：Cary Eclipse荧光光度计(上海波粒仪器科技有限公司)；紫外可见分光光度计(珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司)；pHS-3C精密pH计(上海大普仪器有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；数显恒温水浴锅(菏泽市石油化工仪器厂)。

Cu(II)标准储备溶液(28 μmol/L)：称取 0.525g干燥的硝酸铜(Cu(NO3)2)溶于纯水中，后定量转移到1 000 mL容量瓶中，加水定容。

探针标准储备溶液(1.0 mmol/L)：称取0.588 g干燥的探针化合物2溶于适量乙腈中，后定量转移到1 000 mL容量瓶中，定容。

三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液：取50 mL的三(羟甲基)氨基甲烷溶液(0.1 mol/L)和40.3 mL的HCl溶液(0.1 mol/L)混合摇匀，用水稀释至100 mL。用酸度计测量其pH值为7.4。

其它试剂均为分析纯。分析用水为Millipore Mili-Q系统净化超纯水(18 MΩ·cm)。

1.2 胡椒醛-罗丹明B衍生物荧光探针的合成步骤

中间体1的合成步骤参照文献报道的方法[8]。荧光探针2的合成步骤如下：在50 mL圆底烧瓶中，首先将中间体1(0.456 g,1.0 mmol)和胡椒醛(0.225 g,1.5 mmol)溶解于20 mL无水乙醇中，搅拌下回流约8 h。经TLC监测反应结束后，冷却至室温，加入20 mL水后有棕色固体析出。固体用蒸馏水/乙醇（V/V=1/1）洗涤3次，真空干燥，称量得目标化合物，产率为88%。合成步骤具体见图2。

1.3 胡椒醛-罗丹明B衍生物荧光探针识别金属离子

于10 mL的容量瓶中，依次加入一定体积的Cu(II)的标准溶液，0.5 mL中间体1标准储备溶液，2.0 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.4)和5.0 mL乙腈，用纯水定容。不同浓度的Cu2+溶液及其它金属离子溶液体系（Hg2+,Ag+,Pb2+,Fe3+,Ni2+,Co2+,Cd2+,Al3+,Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+）的制备均采用上述步骤。所有的金属离子溶液使用前需放置1.5 h。荧光光谱的激发波长为555 nm(激发狭缝为5 nm)和发射波长为578 nm(发射狭缝为5 nm)。

图2 目标探针的合成路线

2 结果与讨论

2.1 pH对Cu2+的识别性能的影响

首先考察了pH对荧光探针对铜离子识别性能的影响。如图3所示，在乙腈/水(V/V=1/1)体系中，当探针浓度为50 μmol/L时，比较无Cu2+存在时和Cu2+浓度为2.8 μmol/L时，在不同pH条件下，578 nm处的荧光强度变化。从图中可以清晰可见，当无Cu2+存在时，pH为5.0至9.0范围内无明显的荧光响应；但加入Cu2+后，荧光强度增强，且在相同的pH范围内荧光响应保持稳定，说明探针2在较宽的pH范围内对Cu2+具有识别功能。后续实验均在pH=7.4下进行。

2.2 探针对Cu2+紫外吸收光谱识别性能的研究

为了使探针2更好地应用于Cu2+识别，本文考察了目标探针与Cu2+的络合模式。如图4和图5所示，探针溶液呈无色且在可见光区无明显吸收。在乙腈/水(V/V=1/1)体系中，逐渐加入0 ～ 12.6 μmol/L Cu2+溶液后，溶液由无色变为粉色，紫外可见光谱在555 nm处出现强吸收峰。同时，随着Cu2+浓度的增大，紫外可见吸收逐渐增强。说明探针2中的罗丹明内酰肼螺环已打开。

图4 不同浓度的Cu2+溶液颜色变化

图5 乙腈/水溶液中，加入C u2+溶液后的紫外吸收-可见光谱

其次，通过利用Job曲线法，即紫外吸收光谱-连续摩尔递变法来研究探针与Cu2+的计量比。在此实验中，固定探针2和Cu2+的总浓度为100 μmol/L，当Cu2+摩尔分数接近50%时，555 nm处紫外光谱吸收达到最大，说明探针/Cu2+的摩尔计量比约为1∶1。

2.3 探针对Cu2+荧光光谱识别性能的研究

图6为探针2对不同浓度Cu2+的荧光响应图。由图可见，纯探针溶液的荧光强度非常弱，但随着Cu2+(0～12.6 μmol/L)溶度的增加，体系的荧光强度明显增强。从荧光滴定曲线图7可以看出，Cu2+溶度在0～2.8 μmol/L范围内与荧光强度呈线性关系(y=68.69 x+51.85,R2=0.998)。

图6 目标探针在乙腈/水体系中,加入Cu2+溶液后的荧光光谱图

图7 目标探针与Cu2+溶液的线性相关

2.4 探针对Cu2+的识别机理研究

以上研究表明，探针2对Cu2+具有识别功能，同时紫外滴定实验表明探针与Cu2+的摩尔比为1∶1。因此，探针对Cu2+的识别机理如图8所示，Cu2+与目标探针中的N、O原子络合的同时导致探针内螺环的C-N键断裂，使分子体系共轭程度增加，从而导致荧光产生。

图8 探针对Cu2+的识别机理

2.5 探针对Cu2+的选择性研究

为了考察所合成的探针对Cu2+的识别是否具有好的选择性，在乙腈/水(V/V=1/1)体系中研究了探针2对多种金属离子的荧光响应。如图9所示，在50 μmol/L的探针溶液中依次分别加入下列金属离子(10 μmol/L)：Cu2+,Hg2+,Ag+,Pb2+,Fe3+,Ni2+,Co2+,Cd2+,Al3+,Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+，观察各金属离子溶液体系的荧光响应。实验结果显示，在578 nm处只有Cu2+有强的荧光响应，说明探针2对Cu2+具有较好的识别选择性和专一性，探针2可以作为开关型的荧光探针来检测Cu2+。

图9 金属离子选择性研究

3 结论

通过2步简单反应合成了一种新型的罗丹明B衍生物荧光探针，并将其应用于对铜离子的选择性识别。研究表明，Cu2+可诱导所合成的罗丹明B衍生物中螺环开环，使体系共轭程度增强从而出现强的荧光响应。因此，罗丹明B衍生物可作为荧光探针可高选择性、高灵敏度的识别检测金属铜离子。

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