参芍软肝汤抗大鼠肝纤维化的疗效及其对肝星状细胞活化及凋亡的影响

丁晓明 江 波 徐鸿婕 曾江琴 刘黎明

(武汉大学附属同仁医院 武汉市第三医院中医科，湖北 武汉 430060)

Friedman〔1〕认为，肝脏损伤-肝实质炎症、坏死-肝星状细胞(HSC)激活-大量细胞外基质(ECM)沉积，是其核心环节。当不同刺激因素如肝炎病毒、毒性物质如酒精、四氯化碳(CCl4)等、脂肪代谢产物、炎性因子等作用于肝脏可损伤肝细胞，刺激Kupffer细胞产生不同的细胞因子如转化生长因子(TGF)-β1等从而导致HSC激活。HSC是肝纤维化的细胞学基础〔2〕。在正常状态下，HSC处于肝窦周围间隙中，通过释放可溶性炎性因子和产生ECM来促进肝细胞间相互作用。当肝脏受到各种刺激因素的作用发生损伤后，HSC将被激活〔3〕。活化的HSC分泌更多的ECM，包括α平滑肌动蛋白(SMA)、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ等，此外HSC也分泌基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)促进ECM降解，当合成的ECM多于其降解，平衡受到破坏将会导致肝纤维化〔4～7〕。目前抗肝纤维化的治疗可作用于肝纤维化形成过程中的任何一个阶段，而HSC的持续激活是肝纤维化的重要因素，因此抑制HSC的活化状态减少ECM的沉积被认为是有效的逆转肝纤维化的一个方法〔8〕。

近年来，中药在防治肝纤维化方面取得了不少进展。本项目组前期就开展了活血燥湿、化瘀软肝法治疗肝病的临床与实验研究〔9，10〕，并初步认识到活血燥湿、化瘀软肝类制剂在防治脂肪肝、肝纤维化、肝癌的疗效及其作用，认识到抗肝纤维化的疗效与其调整免疫功能、防止肝损伤、纠正蛋白比例失调、促进微循环、改善肝脏病理的作用相关。而参芍软肝汤复方制剂(丹参、白芍、郁金、海藻、制鳖甲、垂盆草、女贞子等)，目前已尝试用于临床治疗肝纤维化，但是关于其中的机制仍需研究。本文研究参芍软肝汤对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的治疗作用，通过检测肝纤维化程度的血清学指标透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ-C型胶原(Ⅳ-C)和Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)和血清中冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)的表达水平，观察参芍软肝汤能否逆转CCl4诱导的大鼠肝纤维化，并探讨参芍软肝汤对HSC活化与凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1细胞及主要试剂 HSC-T6为永生化的大鼠HSC系，该细胞系已知几乎保留活化HSC的所有功能，α-SMA表达阳性，本研究以传代12代以内用作实验。RPMI1640和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCl4购自南京博全科技有限公司；参芍软肝汤复方制剂含丹参、白芍、郁金、海藻、制鳖甲、垂盆草、女贞子、制附片、茯苓、炙甘草10味中药；RNA逆转录试剂盒购自美国Promega公司；Real Time-PCR试剂(SYBR Green Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购自美国BD公司；全自动生化分析仪检测大鼠血清ALT、AST和ALB生化指标为美国贝克曼公司，大鼠血清HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自南京安培化工科技有限公司，检测仪器为美国Biotek酶标仪。

1.2动物 清洁级 Sprague-Dawlay(SD)大鼠购自湖北中医药大学动物实验中心。共32只，雄性，体重(180±20)g。建立肝纤维化模型：将SD大鼠随机分为正常对照组和肝纤维化模型组各16只，其中模型组大鼠皮下注射40% CCl4植物油溶液(1 ml/kg)，2次/w，持续8 w，制成大鼠肝纤维化模型。正常对照组以同样方法注射等量植物油。动物分组：正常对照组随机分为正常组8只，药物组 8只，建模组随机分为模型组 8，治疗组8只。药物组及治疗组在造模同时给药，每次剂量为2 g/kg，溶于生理盐水中灌服，灌胃2次/w，其他组同期灌服相当量的生理盐水溶液。

1.3血清样本的测定 实验进行8 w末处死各组大鼠，取下腔静脉血液，分离血清样本。全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST和ALB生化指标，同时ELISA法测定血清中HA、LN、Ⅳ-C和 PC-Ⅲ的水平。

1.4药物血清的制备 将上述分离的各组大鼠血清，于56℃热灭活30 min，过滤除菌，加入RPMI1640培养液，配制成10%的培养基。然后将HSC-T6以1×105密度接种于6孔板，每组4复孔，同时用无血清的RPMI1640饥饿培养24 h，使细胞周期同步于G0期。 24 h后用上述四种血清继续培养18 h，分别用于收取细胞用于提取RNA和细胞凋亡检测。

1.5Real Time-PCR法 用Trizol收取上述四组不同处理的血清培养的HSC-T6，用氯仿抽提法得细胞RNA，经逆转录得cDNA，应用罗氏荧光定量PCR Lightcycler 480采用三步法进行定量检测实验，反应条件第一步预变性95℃ 5 min，第二步循环反应(设置40个循环数)95℃ 10 s，60℃ 30 s，溶解曲线95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。所用引物见表1。

表1 Real Time实验中检测基因的上下游引物序列

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡 上述四组细胞分别用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂标记后用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验，应用GraphPad Prism4.0软件作图。

2 结 果

2.1各组血清肝功能指标的变化 与正常组比较，模型组ALT、AST、ALB表达水平明显升高(P<0.05)，与模型组比较，治疗组ALT、AST表达水平明显降低，ALB水平明显升高(P<0.05)。见表2。

2.2各组血清肝纤维化 4项指标的变化 与正常组比较，模型组HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ明显升高(P<0.05)，与模型组比较，治疗组HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ明显降低(P<0.05)，见表3。

2.3参芍软肝汤对HSC-T6活化的影响 与正常组相比，药物组α-SMA和TGF-β1 mRNA的表达水平受到明显抑制(P<0.01)，与模型组相比，治疗组α-SMA和TGF-β1 mRNA的表达水平明显降低(P<0.001)。见表4。

2.4参芍软肝汤对HSC-T6凋亡的影响 与正常组相比，药物组能明显促进HSC-T6的凋亡水平(P<0.001)，与模型组相比，治疗组HSC-T6细胞的早期凋亡和总的凋亡水平也明显增加(P<0.001)。见表5。

表2 各组血清中ALT、AST、ALB的表达水平比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，表3同

表3 各组肝纤维化血清指标的变化

表4 各组肝脏α-SMA和TGF-β1 mRNA表达的比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.001；表5同

表5 参芍软肝汤对HSC-T6凋亡率的影响

3 讨 论

肝纤维化是机体对各种致病因素引起的慢性肝损伤后的一种自我修复反应，尽管早期的肝纤维化临床症状不是很明显，但当肝脏受到持续的损伤时，肝纤维化可进一步发展成肝硬化，肝硬化可导致一系列严重的并发症，如门脉高压、肝性脑病和肝衰竭等。有报道显示，肝硬化5 年、10 年后发展成肝癌的概率分别为17%、40%〔13〕。目前肝移植是严重肝病唯一有效的治疗措施，但肝纤维化在某种程度上可逆转〔14〕。 因此有效的抗纤维化药物十分必要〔15〕。其中HSC激活是肝纤维化过程中的一个关键环节，在正常肝脏中，HSC主要的功能是存储维生素A，然而，当肝脏受到损伤，HSC活化，活化的HSC可导致肝纤维化。所以诱导HSC凋亡可能有助于纤维化终止〔16，17〕。HSCs 凋亡是一个生理性的过程，由细胞外的调节因素与其细胞表面的受体结合，经活化的受体启动胞内第二信号系统，激活核酸内切酶，引起DNA 裂解，进而引发细胞凋亡，表现为一种程序化细胞形态学改变过程。HSCs 吞噬的凋亡小体可能直接刺激肝纤维化。抑制HSCs激活、诱导其凋亡环节是逆转肝纤维化进展的一个有效治疗靶点。因此，抑制HSCs 激活，促进其凋亡，是肝纤维化逆转的主要机制。基础和临床研究证实有效的病因治疗、抑制细胞外基质的合成或促进其降解，肝纤维化甚至早期肝硬化也是可以恢复的。目前对慢性肝病的病因治疗已有了一定的手段，如抗病毒药物的运用对控制乙肝和丙肝的病情发展起积极作用，但却不能完全取代抗肝纤维化治疗，因为对于已经形成的肝纤维化其疗效是有限的，甚至有些慢性肝病即使病因去除了，但肝纤维化的发展却没有停止。目前较公认的治疗肝纤维化的药物有γ干扰素，丹参类制剂、桃仁类制剂及活血化瘀法、益气活血制剂。

目前研究的药物大部分单一地作用于肝细胞或者星状细胞。参芍软肝汤有活血燥湿、疏肝化瘀、清热解毒等作用，可以缓解肝硬化的发生发展，目前已在临床用于预防与治疗肝纤维化。其组方药物应用于不同的靶细胞，减少肝细胞凋亡，抑制星状细胞活化，从而达到增加星状细胞凋亡的效果，较好地作用于肝纤维化的治疗。本研究结果提示了参芍软肝汤可以明显减轻甚至逆转肝纤维化。抑制HSC的激活过程可能是参芍软肝汤减轻肝纤维化的一个机制。参芍软肝汤另一方面是通过促进HSC凋亡来实现减轻肝纤维化的目的。肝纤维化的治疗一般是作用于肝纤维化的不同过程，尤其是其中激活HSC的环节，而参芍软肝汤明显抑制活化的HSC表达α-SMA和TGF-β1，同时促进活化的HSC凋亡，从根本上减少ECM的沉积，逆转肝纤维化过程。另外，有文献报道，层黏连蛋白、胶原蛋白Ⅳ及胶原纤维的增生是导致肝硬化恶化的重要原因〔18，19〕。参芍软肝汤中的成分如丹参、白芍、鳖甲等能促进ECM中胶原的降解，而海藻、女贞子和炙甘草还能起到保护肝细胞的功能，促进肝细胞的再生，从而间接阻止肝纤维化的进展。中医理论认为，肝纤维化过程中肝细胞的解毒、合成等功能受到干扰，进而引起气滞血瘀、肝失疏泄、肝血不足、脾胃运化失调等病理变化〔20〕。通过调节肝脏气血、改善血淤、散热解毒等方式，可以改善间质代偿性增生〔21〕。另外中药大部分来源天然植物，减少了药物本身的毒副作用，且中药的治疗强调整体观念，各成分之间相互制约又相互补充，形成“多靶点”的协同作用，临床疗效显著。

4 参考文献

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