香水椰子主要香味化合物2AP的研究进展

吴玉双 李静 吴翼 许丽菁 杨耀东

摘 要 香水椰子（Cocos nucifera L.）是绿矮椰子中的一个突变品种，因具备特殊的香味而在市场中备受青睐。研究发现它的香味主要成分是2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP），这对于具特殊香味椰子品种的早期选育具有重要的意义。本文主要综述了2AP的相关研究进展，介绍2AP在其他作物的研究现状及其定性和定量的分析方法，对2AP的生物合成、相关基因及其调控机理等方面的研究进行了论述，最后对2AP相关研究的应用前景进行了展望。

关键词 香水椰子 ；2-乙酰-1-吡咯啉 ；生物合成

中图分类号 S667.4 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.03.015

Abstract Aromatic coconut （Cocos nucifera L.） was a mutant of green dwarf coconut and favored in the market for its special aroma. The main component of its aroma was 2-acetyl-1-pyrroline （2AP）， which was of great significance for early breeding of coconut varieties with special flavor. The research progress of 2-acetyl-1-pyrroline （2AP） were reviewed. The current research status， qualitative and quantitative analysis methods of 2AP in other crops were introduced. The biosynthesis， related genes and regulatory mechanisms of 2AP were analyzed. A prospect of future application of 2AP was made.

Keywords aromatic coconut ； 2-acetyl-1-pyrroline ； biosynthesis

世界中充满了风味和香味，是由于植物产生和散发出许多挥发性物质。而香味和舒适的口感直接决定了消费者对食物的喜好和选择，香味特征也有助于不熟悉的消费者接受产品。香水椰子（Cocosnucifera L.） 因具备特殊的香味而具有巨大经济价值，它是绿矮椰子中的一个特异变种类型，原产于泰国[1]，就像印度香米巴斯马蒂、泰国香米Khao Dawk Mali、日本香米Kaorimai一样，因具备香味而在市场中备受欢迎，并且价格较高。在泰国，香水椰子已经变成了一个重要的农业商品，嫩果和椰子水被出口到许多国家，包括美国、澳大利亚、新加坡和中国等（Thailand's Office of Agricultural Economics）。而中国是在20世纪90年代才引进香水椰子，它的生长周期长，种植后3～4 a才能开花结果，育种周期长，育种手段单一，因此无法满足人们日益增长的需求[2]。

随着各种研究手段的不断进步，对香水椰子的研究不断深入，研究发现由于2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）的存在而使得香水椰子具备这种特殊香味，它产生的香味是一种隐性性状，只有在纯化的情况下才具有香味[3]。了解2AP的生物合成及其调控基因对香水椰子育种方面具有重要的作用。本文对2AP的物质成分及其生物合成途径进行简单概述。

1 香味主要化合物：2-乙酰-1-吡咯啉

对芳香和非香的香水椰子挥发性化合物的分析表明，2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）的存在使得香水椰子具备特殊的气味[4]。2-乙酰基-1-吡咯啉[2AP；IUPAC名称为5-乙酰基-3，4-二氢-2H-吡咯1-（3，4-二氢-2H-吡咯-5-基）-乙酮]的香味阀值是0.02 ng/L（风味阀值指人的嗅觉器官能感受到的该化合物所需的最小浓度值）[5]，它在自然界中广泛存在，在香叶露兜树叶、Bassia宽叶植物、菠菜、芋头球茎、面包花（纽子花属、马蓝细胞悬浮培养）、大豆、绿豆、高粱、黄瓜、大麦、燕麦和香水椰子等植物中均有发现。2AP还能从可可发酵箱中分离出的芽孢杆菌菌株、希氏乳杆菌和几株真菌中鉴定出來，甚至在老虎的尿液中也有发现。2AP还在多种谷物产品、植物源和动物源性产品中被发现，例如，小麦面包、黑麦面包、面包、吐司、湿磨小米、爆米花和甜玉米制品、中度烤芝麻、长棍面包、淡水龙虾的熟尾肉、煮土豆、野生芒果的烤种子、熟蓝蟹、玉米粉、芋头挥发物、牡蛎、熟的美国龙虾尾巴、热处理的脱脂奶粉、伊比利亚干冻火腿和熟食等。除了生活系统，2AP已被认为是大量加热和加工食品的重要添加剂。2AP是高度不稳定的化合物，不适于长期储存，因此它以天然形式被使用，用于添加到各种食物，如面包店的产品、糖果、饮料、冰淇淋等。露兜树叶也被加入到普通的米饭中，在烹饪时赋予香米香气。2AP含量在香稻中差异很大，如Basmati rice（0.34 mg/L）、Jasmine rice（0.81 mg/L）、KDML brown rice （3.00 mg/L）和Texmati（0.53 mg/L）。在不同植物中含量也各不相同，如山檨子属 （3.00 mg/L）、纽子花（0.34 mg/L）、香水椰子（3.29～21.98 mg/L）、香叶露兜叶（10～12 mg/L）、面包花（26.1 mg/L）。

几十年来，研究人员致力于鉴定使动植物具备独特香味和风味的化合物，报道了数百种挥发性化合物，但未能鉴定出其主要分子。Buttery等[6]在香稻中首次成功鉴定出2AP是产生独特和令人愉快的香味的主要化合物。通过以无香味的水稻品种Texars、Long、Grain和Calrose为对照，测定Basmati370、Malagkit、Hieri和Sungsong等8个香稻品种的2AP含量，发现香稻糙米和精米的蒸馏挥发物中2-乙酰-1-吡咯啉的含量是对照品种的5～10倍，同时还发现8个香稻品种的饭米香味强弱与其含有2-乙酰-1-吡咯啉浓度的高低成正比。Buttery等[5]报道称露兜树叶也含有2-乙酰-1-吡咯啉，蒸煮大米时加入露兜树叶能使米饭具有香稻的香气，经分析发现，露兜树叶主要挥发物的冻干品成分和人工合成的2-乙酰-1-吡咯啉是相同的，验证了其先前得出的2-乙酰-1-吡咯啉是稻米香味主要成分的结论。Arikit等[7]在大豆中鉴定出2AP，并证明2AP是大豆芳香表型的决定因素。Saensuk等[4]在香水椰子中以不香的椰子 BEDO/KU0030、BEDO/KU0033和BEDO/KU0040等10个样品作对照，测定BEDO/KU 0002， BEDO/KU0004等10个香水椰子样品的香气成分，利用气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行定量分析，发现在所有10个不香的样品中均检测不到2AP的存在，而在10个芳香的香水椰子样品中均能检测出2AP，2AP含量变化范围为（3.29±0.20）～（21.98±1.00） mg/L。上述结果表明，所有芳香椰子种质中的这种挥发性化合物——2AP是香水椰子香味的主要化合物成分，其含量差异显著，这可能是由于椰子果实的年龄有所差异，而且受环境因素和土壤性质的影响；此外，遗传控制也可能发挥作用，2AP提取和检测的不同方法也会产生检测水平的差异，这些都需要深入进行标记芳香性状关联分析，然后进行QTL分析，以确定基因效应和量化遗传控制的程度。

2 2AP的鉴定方法

2.1 氢氧化钾浸泡法[8]

称取0.5 g的香水椰子的新鲜叶子，剪碎并放在含有10 mL1.7%氢氧化钾溶液的培养皿中，盖上盖子10 min，打开盖，闻气味。

2.2 香味显色法[9]

该法原理是2-乙酰-1-吡咯啉有一个非活性的吡咯啉环和活性甲基酮组，后者与2，4-二硝基苯肼发生反应得到橘红色化合物2-乙酰苯腙。

2-acetyl-1-pyrroline+2，4-dinitrophenylhydrazine→2-acetyl-phenyl hydrazine

2.2.1 切片法

将样品浸泡过夜使其软化；第2天，用刀片将样品进行手工切割获得横截面，将薄的部分利用不同的酒精级别（10%，20%，30%，50%，70%，90%和无水酒精）浸泡，使之变透明；然后将切片转移到2，4-二硝基苯肼试剂（将2 g 2，4-二硝基苯肼溶解在15 mL浓硫酸中，然后加入15 mL 95%乙醇，用蒸馏水将溶液稀释至150 mL）中，并在热空气烘箱中以60℃孵育30 min，然后制成石蜡切片；用显微镜观察其结构及颜色变化。

2.2.2 薄层层析法

称取100 g的香水椰子叶于1L蒸馏水中蒸馏，将得到的蒸馏产品用乙醚提取挥发性物质；用旋转蒸发仪将提取液在减压、26℃的条件下浓缩至5 mL；将得到的浓缩提取物装载在薄层层析板上，用2，4-二硝基苯肼试剂喷雾将其染色，观察其颜色变化。

2.3 气相色谱-质谱联用法[10]

取50 mL的椰子水（20 g椰肉），加入20 mL乙醚，在分液漏斗中轻摇10 min，重复2次，然后去掉下层水层，取上层有机层；在有机层里加1 g的无水硫酸钠，以10 000 r/min常温离心15 min，使用旋转蒸发仪在减压、26℃的条件下将提取液浓缩至0.5 mL；然后加内标TMP，利用GC-MS进行分析，根据得到的峰面积计算2AP的含量。

3 2AP的生物合成

2AP在自然界中大量存在，与植物、动物、微生物的香味息息相关，而香味是衡量动植物、微生物品质的一个重要指标，也是育种研究的重要内容。在过去的几十年中，大量研究人员对2AP生物合成进行了研究。遗传分析显示，主要的香味性状是受细胞核基因控制的遗传性状，与细胞质基因无关[11]，其中在研究的一些香稻品种中，有些显示单基因控制；而在其他一些情况下，它被认为是一个数量性状，许多基因参与其合成。因此，香味性状是由复杂的遗传控制的。

最初，研究人员采用许多不同的方法，例如RFLP标记，鉴定出一个位于8号染色体上的隐性基因，说明香味基因由它控制；并使用SSR标记芳香水稻和非芳香水稻，发现来自非芳香水稻品种IR36的易位；再通过水稻基因组测序和物理虚拟绘图研究可知，位于8号染色体上的候选基因与甜菜碱醛脱氢酶2（BADH2）同源，并负责香稻2AP香味的合成，badh2基因上8个碱基对的缺失，导致过早产生了终止密码子，一旦编译，则会产生缩短了的非功能蛋白。因此，水稻badh2基因位点构成的隐性基因被认为是香味性状的主要遗传决定因素[12]。在水稻中还发现2个没有香味功能的badh2隐性基因，一个为badh2-E7，位于第7个外显子上，由于8个碱基的缺失和3个单核苷酸多态性（SNPs）的差异而导致翻译提前终止，编码的甜菜碱醛脱氢酶（BADH2）蛋白质结构发生改变，因积累2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）而产生香味，预测badh2基因可能是控制香味性状的基因[13]；另一个为badh2-E2，其具有与badh2等位基因相同的序列，但其在第二外显子中存在7 bp缺失，这些badh2等位基因都有助于水稻风味合成[14]。Badh1与badh2是同源基因，均位于水稻的4号染色体上，它们有相似的分子功能，但其在香味方面的作用还没有被鉴定[15]。通过对GmAMADH1和GmAMADH2基因在芳香族和非芳香族的大豆叶片、幼嫩种子和愈伤组织中的表达情况分别进行研究，利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行分析，结果表明，这2个基因的表达模式不同，但是这些大豆品种中，5种芳香的大豆所有组织的GmAMADH2表达水平均低于5种非芳香品种[7]；相比之下，GmAMADH1的表达水平在所有的10个大豆品种中没有差异，这说明芳香的品种中GmAMADH2低表达与2AP存在关联。Vanavichit等[16]第一次证明badh2基因表达降低会导致2AP的积累，利用RNA干扰技术对Jasmine香米进行研究，结果发现最强的RNAi表达抑制作用最强，但是2AP含量积累最高。另一项研究表明，转基因水稻包含RNAi（通过cDNA反向重复）编码Os2AP，累积相当数量的2AP。Chen等[17]证明在水稻中利用RNAi技术可使badh2基因表达量降低，导致2AP积累，可见badh2决定了水稻2AP的积累。负责高粱香味的基因也像大米一样，高粱的BADH2中含有提前的终止密码子，这损害全长功能性badh2蛋白的合成，导致2AP的积累。Yundaeng等[18]报道了BADH2基因和高粱香味之间的关联，通过QTL分析，确定了BADH2基因决定香味的形成。Juwattanasomran等[19]第一次报道称大豆中氨基酸的置换对BADH2蛋白的功能活性至关重要，表明BADH2中SNP负责大豆香味的合成。Arikit等[7]在黄豆中发现，氨基醛脱氢酶GmAMADH2的10号外显子中等位基因TT缺失引起移码突变和终止密码子提前产生，导致氨基醛脱氢酶失活，从而使得2AP产生。Vongvanrungruang等[20]通过克隆香水椰子中的香味基因甜菜碱醛脱氢酶2（Badh2）发现，该基因与其他植物的Badh2基因高度同源，而芳香族和非芳香族椰子之间的单核苷酸差异导致在位点442处，丙氨酸（非芳香族）转化为脯氨酸（芳香族），这是BADH2的底物结合位点，脯氨酸的环侧链可能使结构不稳定，导致产生无功能的酶，从而使得香水椰子产生香味。Saensuk等[4]对香水椰子进行研究发现，CnAMADH2为水稻香味基因的同源物，在14号外显子上单碱基G变成C，碱基替换引起氨基酸的改變，丙氨酸变成脯氨酸。位点442 （P442A）在此位置的存在可能改变环区域的空间构象，产生不稳定的二聚体构象，随后降低AMADH酶活性，使2AP积累。通过研究发现，香味2AP的生物合成主要是受BADH2基因调控，这对进一步了解其形成机理具有重要意义。

Bradbury等[21]發现，水稻BADH2基因对γ-氨基丁醛（GABald）具有较高的活性，对甜菜碱醛具有中等活性。在水稻中，BADH2调控来自γ-氨基丁酸（GABA）的γ-氨基丁醛（GABald）的代谢，GABAld自发环化为Δ1-吡咯啉，这是2AP的关键前体；BADH2基因第7外显子上8个碱基的缺失和3个核昔酸的多态性使基因翻译提前终止，导致甜菜碱乙醛脱氢酶因不完整而失去原有的功能，从而使香味物质2AP在香型水稻中积聚。功能性的BADH2基因能够编码完整的甜菜碱乙醛脱氢酶，其通过消耗2AP的前体物质而使水稻缺乏香味。Chen等[17]研究表明，水稻中2AP的积累是由于BADH2活性丧失，导致其底物（GABald/Δ1-吡咯啉）水平升高，而游离GABald/Δ1-吡咯啉的利用率是2AP合成速率的控制因子。GABald/Δ1-吡咯啉的可用性取决于多胺和脯氨酸的降解以及BADH2酶的活性，BADH2利用GABald/Δ1-吡咯啉转化成GABA，从而抑制2AP合成，而GABald/Δ1-吡咯啉的积累导致2AP合成增加。Romanczyk等[22]研究表明，在培养蜡状芽孢杆菌的过程中，当用高含量的脯氨酸、鸟氨酸和谷氨酸辅以培养时，2AP的含量会增加，后来，脯氨酸、鸟氨酸、谷氨酸被鉴定为水稻和香叶露兜中2AP生物合成的基本前体。Costello等[23]提出鸟氨酸在2AP合成中作为氮源，通过利用γ-氨基丁醛（GABAld）（一种腐乳酸乳杆菌降解途径中的产物），GABAld自发环化成Δ1-吡咯啉，随后在C-2位置酰基化形成酰基辅酶A衍生物，导致2AP的合成。Cheetangdee等[24]的研究还显示，在香叶露兜中，谷氨酸、脯氨酸、葡萄糖和果糖是2AP可能的前体，甲基乙二醛（丙酮醛）、糖的降解产物被鉴定为2AP的碳源。Saensuk等[4]的研究表明，AMADH基因编码将4-氨基丁醛（ABAL）转化为γ-氨基丁酸（GABA）所必需的AMADH，AMADH基因的突变会导致ABAL的积累，游离ABAL或乙酰化的环状1-吡咯啉将导致2AP的合成。因此，2AP生物合成已被认为是积聚ABAL的解毒途径。与非芳香椰子相比，芳香椰子CnAMADH2基因的第14外显子第442位（P442A）的丙氨酸变成脯氨酸，单个氨基酸改变的位置处于二聚化结构域的环中，其远离底物和辅因子NADH的结合位点；在二聚体模型中，芳香椰子CnAMADH2蛋白序列中的脯氨酸可能使环形区域中的二聚体不稳定，这可能导致CnAMADH2的酶活性降低或丧失，从而导致2AP积累。这些研究结果表明，酶失活导致2AP的合成，这对早期育种具有重要意义。

4 展望

香水椰子糖分含量高，椰肉细腻松软，营养丰富，是优质的天然绿色食品，更因为它具有特殊的香味而备受人们喜爱，在市场上大受欢迎[25]。但是目前为止国内对香水椰子香味的形成机理研究较少，充分了解2AP的生物合成及其调控基因对香水椰子育种方面具有重要的作用，可以通过与2AP相关联的分子标记技术来辅助香水椰子的早期筛选和提高香水椰子的纯度，从而缩短香水椰子的繁育周期，提高香味品质，促进香水椰子产业的发展。

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