高效液相色谱法测定栀子苷含量的不确定度评定

张玉莲

（上海上药华宇药业有限公司，上海200001）

0 引言

高效液相色谱法是以液体为流动相，采用高压泵输送，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分经选择性作用被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析[1]。现今，高效液相色谱法已被广泛应用于中药材含量的检测等领域。在测量中，为评估测量方法的可靠性和测量结果的可信程度，需要对测量的不确定度进行评价。测量的不确定度是与测量结果相关联的参数，表征合理地赋予被测量值的分散性。测量的不确定度越小，测量的可靠性越大[2]。

本文通过建立高效液相色谱法测定含量的不确定度评定方法，对栀子苷含量测定的不确定度进行评价。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 栀子药材

栀子药材为浙江温州基地直接购买，并经上海市中药行业专家张增良老师鉴定为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis[3]。

1.1.2 主要试剂

乙腈、甲醇（色谱级），购自德国默克公司。

1.2 主要仪器

Agilent1200Series高效液相色谱仪，安捷伦公司；METTLERTOLEDOXS205DU分析天平，梅特勒-托利多公司；Milli-QReference纯水机，密理博公司。

1.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（15:85）为流动相；检测波长为238nm。理论塔板数按栀子苷峰计算应不低于1500。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含30μg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末（过四号筛）约0.1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理20min，放冷；再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10mL，置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含栀子苷（C17H24O10）不得少于2.0%[3]。

3 不确定度来源和不确定度分量评定

3.1 数学模型的建立

样品中栀子苷的含量M（%）

式中M——样品中栀子苷的含量（%，g/100g）；

C——标准品溶液的浓度，mg/mL；

V——供试品溶液的稀释倍数；

W——供试品的称样量，g；

A样——供试品峰面积；

A对——对照品峰面积。

3.2 不确定度的来源分析

从样品实验操作过程分析来看，高效液相色谱法测定栀子苷含量引入的不确定度因素主要有以下几个方面：对照品溶液的浓度、供试品溶液的浓度、高效液相色谱法测定时的重复性。

其中：（1）对照品溶液浓度产生的不确定度因素主要包括对照品的纯度、对照品称量、对照品配制；（2）供试品溶液浓度产生的不确定度因素主要包括供试品称量、供试品提取、供试品配制；（3）高效液相色谱法测定时的不确定度因素主要包括仪器测量重复性产生的不确定度。

图1为栀子苷含量测量的不确定度因素分析。合成不确定度urel（M）

式中urel（1）——对照品溶液浓度引入的不确定度；

urel（2）——供试品溶液浓度引入的不确定度；

urel（3）——重复性测量制备引入的不确定度。

3.3 分量的计算

3.3.1 对照品溶液浓度引入的不确定度

对照品溶液浓度引入的不确定度因素包括：对照品纯度、对照品称量、对照品配制过程。

对照品溶液浓度引入的相对标准不确定度urel（1）=

3.3.1.1 对照品纯度引入的不确定度

图1 栀子苷含量测量的不确定度因素分析

经查本次实验用的栀子苷对照品（批号：110749-201718，中国药品生物制品检定所，纯度97.6%），对照品未给出不确定度，该项忽略，即对照品纯度引入的相对标准不确定度urel（纯度）=0。3.3.1.2 对照品称量引入的不确定度

（1）天平型号为METTLERTOLEDOXS205DU，称取对照品15.27mg。经查电子天平的检定证书，电子天平的称量扩展不确定度为0.36mg（k=2），即称量不确定度

（2）由于去皮称量，故示值误差的不确定度可以抵消，即示值不确定度u2=0。

（3）天平示值重复性不确定度，连续称重10mg的标准砝码10次，得到电子天平称量的重复性不确定度u3=0.01068mg。

（4）由于去皮称量，必须计算两次：

称重标准不确定度

称量引入的相对标准不确定度为标准不确定

度除以称量，得

3.3.1.3 对照品溶液的制备过程引入的不确定度

对照品浓度为30μg/mL，配制时先稀释至50mL容量瓶中，再吸取1mL稀释至10mL容量瓶中。该部分引入的不确定度因素主要有以下几个方面：玻璃容器的校准、温度效应、定容重复性。

（1）由玻璃容器校准引入的不确定度：

20℃时，50mL（A级）容量瓶最大允差为±0.05mL，10mL（A级）容量瓶最大允差为±0.02mL，1mL移液枪的最大允差为±1μL，按矩型分布，取k=

50mL容量瓶校准引入的不确定度u1（V50）=

10mL容量瓶校准引入的不确定度u1（V10）=

1mL移液枪校准引入的不确定度u1（V1）=

（2）由温度效应引入的不确定度：

经统计，实验室的温差为±2℃，假设矩形分布，取k=水的膨胀系数为2.1×10-4。

50mL容量瓶温度效应引入的不确定度u2（V50）=

10mL容量瓶温度效应引入的不确定度u2（V10）=

1mL移液枪温度效应引入的不确定度u2（V1）=

（3）由定容体积重复性引入的不确定度：

对50mL、10mL容量瓶、1mL移液枪加水定容至刻度，连续操作10次，称重得到：

50mL容量瓶定容重复性引入的不确定度u3（V50）=0.0391mL；

10mL容量瓶定容重复性引入的不确定度u3（V10）=0.0070mL；

1mL移液枪定容重复性引入的不确定度u3（V1）=0.0008mL。

（4）对照品溶液的制备过程引入的不确定度结果：

对照品溶液的制备过程中，50mL容量瓶引入的 标 准 不 确 定 度 ：u

容量瓶引入的相对标准不确定度为标准不确定度除以标示容量，得：制备过程50mL容量瓶引入的相对标准不确定度urel（V50）

对照品溶液的制备过程中，10mL容量瓶引入标 准 不 确 定 度 ：u

制备过程10mL容量瓶引入的相对标准不确定度urel

对照品溶液的制备过程中，1mL移液枪引入的标 准 不 确 定 度 ：u

制备过程1mL移液枪引入的相对标准不确定度urel

对照品配制过程的合成相对标准不确定度：

3.3.1.4 对照品溶液浓度引入的不确定度分量

对照品溶液浓度引入的相对标准不确定度分量：

3.3.2 供试品溶液浓度引入的不确定度

3.3.2.1 供试品溶液称量引入的不确定度

（1）所用天平为METTLERTOLEDOXS204，称取0.10g。经查天平检定证书，电子天平的称量扩展不确定度为0.36mg（k=2），称量不确定度u10.18mg。

（2）由于去皮称量，故示值误差的不确定度可以抵消，即示值不确定度u2=0。

（3）天平示值重复性误差，取0.1g标准砝码连续称重10次，得到电子天平称量的不确定度u3=0.03162mg。

（4）由于去皮称量，必须计算两次：

称重引入的标准不确定u（称量）=

称量引入的相对标准不确定度urel（称量0.0026。

3.3.2.2 供试品提取引入的不确定度

供试品提取所产生的回收率有着不确定性。由于样品提取不完全，使得栀子苷不能被全部提取到溶液中，因此采用加标回收率实验，连续测试6次，测得供试品提取回收率分别为98.6%、99.0%、99.1%、98.7%、99.5%、100.1%，按极差法计算：

供试品提取引入的相对标准不确定度urel（提取）=

3.3.2.3 供试品配制过程引入的不确定度

供试品配制阶段，需使用25mL容量瓶、25mL移液管和10mL移液管，此过程的不确定度分量计算如下：

（1）由玻璃容器校准引入的不确定度：

20℃时，25mL（A级）容量瓶最大允差为±0.03mL，25mL移液管的最大允差为±0.01mL，10mL移液管的最大允差为±0.02mL，按矩型分布，取k=

25mL容量瓶校准引入的不确定度u容1（V25）=

25mL移液管校准引入的不确定度u移1（V25）=

（2）由温度效应引入的不确定度：

经统计，实验室的温差为±2℃，假设矩形分布，取k=

10mL移液管校准引入的不确定度u移1（V10）=水的膨胀系数为2.1×10-4。

25mL容量瓶温度效应引入的不确定度u容2（V25）=

25mL移液管温度效应引入的不确定度u移2（V25）=

10mL移液管温度效应引入的不确定度u移2（V10）=

（3）由定容体积重复性引入的不确定度：

对25mL容量瓶、25mL移液管和10mL移液管，加水定容至刻度，连续操作10次，称重得到：

25mL容量瓶定容重复性引入的不确定度u容3（V25）=0.0213mL；

25mL移液管定容重复性引入的不确定度u移3（V25）=0.0079mL；

10mL移液管定容重复性引入的不确定度u移3（V10）=0.0095mL。

（4）供试品配制过程引入的不确定度：

供试品配制过程中，25mL容量瓶引入的标准不 确 定 度 ：u容配制过程中25mL容量瓶引入的相对标准不确定度

供试品配制过程中，25mL移液管引入的标准不 确 定 度 ：u移配制过程中25mL移液管引入的相对标准不确定度

供试品配制过程中，10mL移液管引入的标准不 确 定 度 ：u移配制过程中10mL移液管引入的相对标准不确定度

供试品溶液配制过程合成相对标准不确定度：

3.3.2.4 供试品溶液浓度引入的不确定度分量

供试品溶液浓度引入的相对标准不确定度分量：

3.3.3 仪器重复性测量引入的不确定度

对同一样品连续测定6次，测定得到栀子苷的含量分别为3.53%、3.58%、3.61%、3.60%、3.58%、3.62%，测量平均值=3.59%，极差为0.09%。

按平均值=3.59%计算重复性测量引入的相对标准不确定度分量：

3.3.4 栀子苷含量测量的相对合成不确定度

栀子苷含量测量的相对合成不确定度：

4 结果与讨论

4.1 结果

栀子苷含量测量的不确定度结果如下：

（1）测量平均值M=3.59%；

（2）合成标准不确定度uc（M）=M×uc，rel（M）=3.59%×0.0210=0.08%；

（3）扩展不确定度：在95%置信概率下，取包含因子k=2，将合成标准不确定度乘以包含因子计算得到测量结果的扩展不确定度：U=k×uc（M）=2×0.08%=0.16%；

（4）被测栀子药材中栀子苷的含量为3.59%±0.16%，k=2。

4.2 讨论

（1）在不确定度评估中，需根据实验过程充分考虑各个影响因素[4]。本实验经对栀子苷含量测定的各不确定度分量进行分析评估，在影响栀子苷含量测定不确定度的各因素中，对照品称量、重复性测量、供试品溶液的提取引入的不确定度对检验结果的影响较大。在实验中，应加强对称量过程、仪器性能状态以及样品溶液提取过程的控制。

（2）在实验过程中，温度效应会对实验中使用的玻璃容器带来不确定度，影响实验结果，在实验过程中应严格控制检测环境的温度波动。

（3）对照品纯度的不确定度也会影响实验结果，由于本实验所用标准物质未提供不确定度，故本实验忽略该项因素。

[1]武汉大学化学系.仪器分析[M].北京：高等教育出版社，2001.

[2]化学分析中不确定度的评估指南：CNAS-GL06[S].

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[4]王维剑，凌霄，谭会洁，等.HPLC法测定中药中掺入双氯芬酸钠含量的不确定度评定[J].药物分析杂志，2009，29（1）：130-133.