MMP-2/9和Ⅳ型胶原蛋白与胃癌患者胃液芳香族氨基酸浓度变化的关系

刘 健 周丽雅 崔荣丽 金 珠 林三仁 张贺军 韩亚京 张 颖 尚惠茹 李松茹

(北京大学第三医院消化科，北京 100191)

针对胃癌(gastric cancer，GC)诊断的新方法，我课题组历经数十年的探索和研究，建立了基于胃液荧光光谱诊断和筛查胃癌的方法[1]，分离3种芳香族氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)荧光标志物，即酪氨酸(tyrosine,Tyr)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、色氨酸(tryptophan,Trp)，并分别应用液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)和核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance，NMR)的方法进行鉴定[2]。应用高效液相(high-performance liquid chromatography，HPLC)进行定量研究的结果表明，3种胃液游离AAAs可以用于鉴别早期和进展期胃癌与胃良性病变[3]。上述研究成果得到国内外学者的认可[4,5]，并得到蛋白质组学研究领域国际权威期刊Journal of Proteomics[6]和肿瘤学研究领域国际权威期刊Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention[7]的大幅引用。

但胃癌患者胃液AAAs浓度异常升高的机制尚不明确。既往我课题组对这一现象的发生机制进行一系列探索，如参与细胞间L型氨基酸转运的L型氨基酸转运蛋白1(LAT1)，参与细胞内氨基酸代谢的酶如吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和单胺氧化酶(MAO)，以及参与细胞内蛋白质降解/自噬相关的蛋白SQSTM1/p62，但都因为上述蛋白在不同病理类型胃癌组织中的表达差异较大而无法解释各型胃癌患者胃液AAAs浓度均异常升高这一现象[8]。本研究旨在探索参与细胞外代谢的酶及其相关的蛋白，即基质金属蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9)和Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen，Col Ⅳ)蛋白，在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌患者胃液AAAs浓度异常升高之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究经北京大学第三医院伦理委员会批准(IRB00006761-2016058)。

纳入标准：①因上腹不适等消化道症状就诊，行胃镜及胃黏膜活检；②年龄≥18岁；③胃液中无食团、出血及胆汁反流。

排除标准：①经历过胃、食管或十二指肠手术或放化疗；②合并其他部位或血液系统恶性肿瘤；③合并外伤及严重基础性疾病；④孕妇或哺乳妇女。

在患者知情同意下，2015年12月～2016年8月共收集120例患者的胃黏膜组织(胃窦和胃体至少各1块)和胃液标本。肿瘤分级依据国际抗癌联盟(UICC)第7版胃癌TNM分期，组织学形态分型依据世界卫生组织(WHO)第4版胃癌分型，异型增生(atypical hyperplasia，ATP)的诊断依据帕多瓦国际分类标准，慢性胃炎(chronic gastritis，CG)的诊断依据新悉尼系统标准。根据病理诊断结果分为胃癌(GC)组和胃良性病变(non-neoplastic gastric diseases，NGD)组。GC组29例，年龄31～84岁，(60.2±13.6)岁；男19例，女10例；病理为管状腺癌17例，低分化腺癌6例，印戒细胞癌4例，黏液腺癌2例；早期11例(ⅠA期10例，ⅠB期1例)，进展期18例(Ⅱ期4例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例)。NGD组91例;年龄29～88岁，(62.4±13.4)岁;男35例，女56例;病理为胃黏膜异型增生46例，胃黏膜萎缩/肠化28例，慢性浅表性胃炎17例。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 兔抗人MMP-2多克隆抗体(ZA-0331)、兔抗人MMP-9单克隆抗体(ZA-0562)、小鼠抗人Col Ⅳ单克隆抗体(ZM-0081)、山羊抗兔IgG/HRP聚合物(PV-6001)、山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物(PV-6002)、胃蛋白酶消化液(ZLI-9013)、柠檬酸组织抗原修复液(pH 6.0)(ZLI-9065)、磷酸盐(phosphate buffered saline, PBS)缓冲液(ZLI-9065)、二氨基联苯胺(diaminobezidin，DAB)显色试剂盒(ZLI-9018)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。甲醇(色谱纯)(美国Fisher Scientific公司)，甲酸(色谱纯)(美国Dikma公司)，3种AAAs标准品(美国Sigma公司)，3种AAAs氘标记(英国CIL公司)。组织自动脱水机、包埋机、石蜡切片机、烘片机均产自德国Leica公司；生物显微镜产自日本Nikon公司；数字病理切片扫描仪产自日本Harmatamo公司。液相色谱仪(LC20-A)产自日本岛津公司；液相色谱串联质谱仪(QTRAP 5500)产自美国Applied Biosystem公司；一次性使用吸痰包产自中国苏州可邦高分子医疗器械有限公司。

1.2.2 组织标本处理及免疫组织化学法检测MMP-2、MMP-9和Col Ⅳ蛋白的表达 组织标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。一张常规HE染色，余做免疫组化染色。免疫组化染色采用EnVision二步法，MMP-2和MMP-9蛋白采用高温高压组织抗原修复法，Col Ⅳ蛋白采用胃酶消化法修复组织抗原，染色步骤按试剂盒说明进行，DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。

由2位消化病理医师应用双盲法独立观察，每张切片随机选取至少5个高倍视野，对阳性染色细胞进行计数并评分，取平均值。若2位病理医师评分结果差异较大，则经讨论达成共识，或请第3位年资更高的病理医师协助完成。

MMP-2和MMP-9蛋白阳性着色显示为细胞胞质呈淡黄色至棕褐色着色；Col Ⅳ蛋白阳性着色显示为胃腺体和脉管周围基底膜有连续、环形淡黄色至棕褐色颗粒沉着。MMP-2和MMP-9蛋白阳性染色评分标准[9]：阳性细胞比例：无为0分，<10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度：无为0分，弱或淡黄色为1分，强或棕黄色为2分，极强或棕褐色为3分。阳性细胞比例×染色强度：0～3分为(-)，4～5分为(+)，6～8分为(++)，>8分为(+++)，(-)和(+)为阴性，(++)和(+++)为阳性。

Col Ⅳ蛋白阳性染色评分标准[10]：根据腺体周围基底膜线性染色的完整性分为：(-)基底膜基本缺如：线状结构<10%，或呈碎片状表达，记0分；(+)基底膜大部缺损：线状结构介于10%～25%，呈细小的条索状表达，记1分；(++)基底膜基本存在：线状结构介于25%～50%，呈条索状表达，记2分；(+++)基底膜大部保留：线状结构介于50%～75%，呈断线状表达，记3分；(++++)基底膜基本完整：线状结构>75%，呈连续、环形表达，记4分。(-)和(+)为阴性；(++)、(+++)和(++++)为阳性。

1.2.3 胃液标本处理及AAAs浓度检测 禁食一夜，于胃镜下通过一次性吸痰管收集5～10 ml胃液。将收集到的胃液置于干冰上短期保存，3000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，分装入2 ml冻存管，置于-80 ℃长期保存。检测前将胃液从超低温冰箱(-80 ℃)中取出，冰浴解冻；加入100%甲醇(1∶10)漩涡振荡(2 min)离心(15000 r/min，4 ℃，5 min)，沉淀蛋白；取上清，加入纯化水(1∶1～1∶5)稀释。待高效液相色谱串联质谱分析。

应用梯度洗脱反相液相色谱分离AAAs(流动相的选取，水相为1/1000甲酸，有机相为纯甲醇)，使用电喷雾离子源(ESI+)，多重离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式检测AAAs质谱信号。使用Phenomenex synergi Polar-RP 80A色谱柱(长度50 mm，内径2.0 mm，填料粒径4 μm)，流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液，2.0 μl进样。梯度洗脱，液相色谱反应条件设置：在0～2 min期间，流动相A所占的比例从3%逐渐升高到50%；在2～3 min期间，流动相A所占的比例维持在50%；在3.0～3.1 min期间，流动相A所占的比例从50%迅速下降到3%；在3.1～6.5 min期间，流动相A所占的比例维持在3%。流速0.25 ml/min，进样量2 μl，柱温30 ℃，分析时长6.5 min。质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式检测(ESI+)；离子喷射电压3500 V；温度550 ℃；源内气体1(GS1，N2)压力50 units；气体2(GS2，N2)压力40 units；气帘气压力40 units；扫描方式为MRM模式；碰撞气(N2)压力Media；每个氨基酸化合物的MRM条件见表1。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色谱峰对应的保留时间分别为1.0、1.4和2.9 min，质谱信号无干扰。

表1 LC-MS/MS检测芳香族化合物的MRM条件

LC-MS/MS：高效液相色谱串联质谱；MRM：多重离子反应监测；酪氨酸-d2：酪氨酸氘标记；苯丙氨酸-d5：苯丙氨酸氘标记；色氨酸-d8：色氨酸氘标记

1.2.4 LC-MS/MS定量检测胃液中AAAs的标准曲线、回收率和准确度 使用双蒸水分别配制8个浓度(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/ml)的标准液，每个浓度标准液内所含L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的量均相等，-20 ℃保存，检测胃液AAAs浓度时取出用于标定建立AAAs定量的标准曲线。以待测化合物信号峰面积/内标峰面积的比值和化合物浓度作图，得到其标准曲线的线性关系。

标准曲线、线性回归系数以及线性区间分别为：酪氨酸，y(浓度)=1.79x(化合物峰与内标峰面积比值)+0.0236，r=0.9994，0.1～20.0 μg/ml；苯丙氨酸，y=1.14x+0.0171，r=0.9985，0.1～20.0 μg/ml；色氨酸，y=1.09x+0.0493，r=0.9988，0.1～20.0 μg/ml。加样回收率分别为：酪氨酸101.6%～101.8%，苯丙氨酸98.5%～107.3%，色氨酸98.2%～111.7%。精密度分别为：酪氨酸2.63%～7.04%，苯丙氨酸1.32%～8.93%，色氨酸，1.90%～11.02%。以上结果均支持本定量胃液中AAAs的实验体系可靠稳定。若检测到的游离AAAs浓度超出标准曲线的浓度范围，则需要将原样本重新稀释后再进行检测。如果样本中游离AAAs浓度过低，超出检测下限，则将其视为零。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

见图1。GC组中，MMP-9在肿瘤组织中的表达以间质炎细胞表达为主，在肿瘤上皮细胞中仅有3例呈局灶的弱阳性表达，且这3例间质炎细胞中MMP-9均呈强阳性表达。MMP-9蛋白的阳性表达与炎症活动关系密切，24例MMP-9蛋白阳性表达的肿瘤组织均伴有炎症活动，其余5例MMP-9蛋白阴性表达的肿瘤组织均不伴有炎症活动。NGD组中，MMP-9蛋白在伴有炎症活动的28例胃良性病变组织中，11例(39.3%)呈阳性表达，而在不伴有炎症活动的63例胃良性病变组织中，仅12例(19.0%)呈阳性表达。

图1 不同病理类型胃黏膜组织中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白免疫组织化学染色(×20)，GC为胃癌，ATP为异型增生，CG为慢性胃炎

GC组中MMP-2和MMP-9蛋白在肿瘤上皮细胞和间质炎细胞中的阳性表达率[89.7%(26/29)和82.8%(24/29)]显著高于NGD组[41.1%(37/90)和25.6%(23/90)](χ2=20.746，P=0.000；χ2=30.033，P=0.000)，Col Ⅳ蛋白的阳性表达率[10.3%(3/29)]显著低于NGD组[71.4%(65/91)](χ2=33.416，P=0.000)(1例慢性胃炎患者行MMP-2蛋白检测及1例异型增生患者行MMP-9蛋白检测时，胃窦胃体2个部位均脱片严重，未进行评分和统计)。应用免疫组织化学染色评分表示蛋白的表达水平，GC组MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平[中位数8(3～12)，9(4～12)]显著高于NGD组[4(0～8)，4(0～9)](Z=-6.324、-6.588，P均=0.000)，Col Ⅳ蛋白的表达水平[0(0～3)]显著低于NGD组[2(0～4)](Z=-6.300，P=0.000)，见图2A。

2.2 胃液游离AAAs浓度检测结果

GC组胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的浓度分别为28.3(1.08～323)，37.9(2.33～362)和10.1(0.424～124)μg/ml，均显著高于NGD组的3.91(0.155～54.5)，5.30(0.118～93.0)和1.05(0.044～75.5)μg/ml(Z=-5.205、-5.710、-5.631，P=0.000)，见图2B。

2.3 胃黏膜组织中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白表达水平的关系

应用免疫组化评分表示上述3种蛋白在胃黏膜组织中的表达水平，Spearman相关性分析结果表明，MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平呈正相关关系(ρ=0.418，P=0.000)，二者均与Col Ⅳ蛋白表达水平呈负相关关系(ρ=-0.454，P=0.000；ρ=-0.383，P=0.000)，见图3。

2.4 胃黏膜组织中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白表达水平与胃液AAAs浓度间的关系

胃黏膜组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平均与胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸浓度呈正相关关系(MMP-2与酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的相关系数分别为ρ=0.262、0.295和0.293，P=0.004、0.001和0.001，MMP-9分别为ρ=0.442、0.437和0.400，P均=0.000)，而Col Ⅳ蛋白的表达水平与胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸浓度之间呈负相关关系(ρ=-0.283、-0.280和-0.273，P=0.002、0.002和0.003)，见图4。

3 讨论

基质金属蛋白酶(MMPs)是在1962年发现的一组锌离子依赖性内肽酶，是由28种MMP构成的超家族，各型MMP之间具有一定的特性。许多研究报道MMP-2/9通过降解基底膜和细胞外基质中的Col Ⅳ蛋白，在胃癌发生和发展的过程中发挥重要作用[11,12]。因此，本研究从细胞外代谢入手，以Col Ⅳ蛋白为靶点，MMP-2/9为切入点，游离AAAs为代谢产物，以期解释胃癌患者胃液AAAs浓度异常升高的原因。

本研究结果表明，胃癌组织中MMP-2蛋白在肿瘤细胞胞浆和间质炎细胞中的表达均明显增强，尤其是在肿瘤组织的浸润前缘，阳性表达率为89.7%，这与既往研究报道相同[13,14]。但MMP-9蛋白在肿瘤细胞胞浆中几乎无表达或局灶呈弱阳性表达，却在肿瘤间质的炎细胞中大量表达，且表达水平与肿瘤组织中炎症的活动程度关系密切，表达部位与肿瘤组织中的微血管分布相一致。偶见浸润到腺上皮细胞中的炎细胞表现为MMP-9蛋白阳性表达。本研究观察到的MMP-9蛋白表达模式与Bergin等[15]的报道一致，即MMP-9蛋白在幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)阳性的上皮固有层间质细胞中呈阳性表达，而在幽门螺杆菌阴性的组织细胞中无表达；幽门螺杆菌阳性的胃黏膜组织中MMP-9的活性是幽门螺杆菌阴性胃黏膜组织的19倍。此外，本研究观察到绝大部分MMP-9蛋白于肿瘤间质的炎细胞中和癌巢周围的坏死渗出灶中大量表达。这可能与胃癌组织常伴较严重的炎性反应，或胃癌组织坏死后渗出的过程中会引起较严重的炎症反应有关。大量炎症细胞富集在肿瘤组织周围，合成并分泌大量的MMP-9蛋白，然后释放到细胞外基质中。也有可能是肿瘤细胞合成MMP-9蛋白后将其分泌到细胞外基质中，被单核巨噬细胞或中性粒细胞吞噬，进而表现为肿瘤细胞不表达或低表达，而间质细胞表达或高表达MMP-9蛋白。总之，炎症和肿瘤相互促进，形成恶性循环。肿瘤细胞和间质细胞通过MMP-9等蛋白进行对话，维持或打破原有的分子之间的平衡，形成具有一定特征的肿瘤微环境。

本研究应用LC-MS/MS法检测，观察到GC患者胃液中3种游离AAAs的浓度均显著高于NGD，与我课题组既往应用HPLC法检测的结果一致[2,3]。但是HPLC法检测一例至少需要30 min，检测效率较低，且样本的前处理方法也比较复杂，大大限制了其临床应用的可行性。本研究应用LC-MS/MS法的优势在于：①前处理的方法相对简单，不需要衍生，直接沉淀蛋白稀释后即可进样，显著缩短分离和分析的时间，可以达到高通量检测的标准；②同位素内标法灵敏度高，因为与非同位素内标法相比，该方法更能有效改善基质效应。因此，LC-MS/MS法可以简便、快速、准确、高通量地检测胃液游离AAAs浓度。

MMP-2/9以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质中的胶原蛋白，参与许多病理过程，如在多种恶性肿瘤发生发展的过程中发挥重要作用[16]。既往几项临床研究表明，MMP-2和MMP-9可以促进恶性细胞的进展，可能会促进肿瘤的生长、侵袭和转移，因为其有降解细胞外基质和基底膜中Col Ⅳ蛋白的能力[17]。本研究结果表明，MMP-2和MMP-9蛋白表达水平呈正相关关系，二者均与Col Ⅳ蛋白表达水平呈负相关关系，这与既往国内外研究报道的结果一致。类似的是，Ruan等[10]报道胃癌组组织蛋白酶D(cathepsin D，Cath-D)的阳性表达率与基底膜中Col Ⅳ的连续性表达率呈负相关关系(r=-0.33，P=0.015)。总之，肿瘤组织发生浸润转移一定伴有基底膜的破坏，这一过程可以通过MMP-2/9、Cath-D和其他蛋白酶来实现。

本研究结果表明，胃黏膜组织中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白的表达水平与胃液3种AAAs浓度之间均存在一定的相关性(P<0.01)。具体来说，MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平与胃液3种AAAs浓度呈正相关关系，而Col Ⅳ蛋白的表达水平与胃液3种AAAs浓度呈负相关关系。上述每一种蛋白与胃液3种AAAs间的相关系数都基本一致，而3种蛋白中以MMP-9蛋白与胃液AAAs浓度之间的相关性最高。考虑与MMP-2蛋白相比，除分解Col Ⅳ外，MMP-9蛋白还可能通过促进新生血管生成，以

图2 MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白在胃黏膜组织中表达水平的散点图(A)；胃液3种AAAs浓度的散点图(B)(Tyr为酪氨酸，Phe为苯丙氨酸，Trp为色氨酸，***表示2组间P=0.000) 图3 MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白在胃黏膜组织中表达水平的相关性(ρ为Spearman相关系数) 图4 胃黏膜组织中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白表达水平与胃液AAAs浓度的相关性(ρ为Spearman相关系数，Tyr为酪氨酸，Phe为苯丙氨酸，Trp为色氨酸)

及增加胃黏膜和毛细血管的通透性，增加胃液AAAs浓度。也有可能MMP-9蛋白通过促进其他蛋白如COX-2等表达增强，从而发挥类似作用[18]。

总体来说，胃癌组织通过上调MMP-2和MMP-9蛋白的表达，降解基底膜和细胞外基质中Col Ⅳ蛋白，可能是胃癌患者胃液游离AAAs浓度异常升高的原因之一。

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