基于灰色关联度的当归及其不同药用部位质量评价研究

2018-06-20吴国霞杨秀娟邓毅陈晖杨延泽杨志军

中国中医药信息杂志 2018年5期

吴国霞杨秀娟邓毅陈晖杨延泽杨志军

摘要：目的以当归及其不同药用部位中5个质量指标为依据，建立基于灰色关联度模型的当归及其不同药用部位的质量评价模式。方法根据2015年版《中华人民共和国药典》通则项下规定对当归及其不同药用部位的理化检识项目进行测定，采用HPLC及分光光度法分别测定阿魏酸及当归多糖含量。结果当归及其不同药用部位样品的相对关联度介于0.435～0.576且比较集中，其中，全当归相对关联度为0.505，当归尾相对关联度为0.576，略高于当归身和当归头样品。结论基于多指标测定的灰色关联度分析可系统、全面比较当归及其不同药用部位的质量，为当归药用资源的高效合理利用及药用新资源的开发提供依据。

关键词：当归；药用部位；灰色关联度；质量评价

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.017

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）05-0077-05

Study on Quality Evaluation of Angelicae Sinensis Radix and Its Different Medicinal Parts Based on Gray Relational Analysis

WU Guo-xia1， YANG Xiu-juan1， DENG Yi1，2， CHEN Hui1， YANG Yan-ze1， YANG Zhi-jun1，2

1. College of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemical and Quality Research for Traditional Chinese and Tibetan Medicines of Gansu Province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To establish the method of quality evaluation of different medicinal parts of Angelicae Sinensis Radix based on gray relational analysis on the basis of five quality indexes of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts. Methods According to the provisions of general rules of the People's Republic of China Pharmacopoeia 2015， the physicochemical identification items of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts were determined. The contents of ferulic acid and angelica polysaccharides were determined by HPLC and UV-Vis spectrophotometry. Results The relative degree of the samples of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts ranged from 0.435 to 0.576. The relative degree of Angelicae Sinensis Radix was 0.505， and the relative degree of tail part was 0.576， which was slightly higher than body and head parts. Conclusion The gray relational analysis based on the multi-index determination can systematically and comprehensively compare the quality of Angelicae Sinensis Radix and its different medicinal parts， and can provide the basis for the efficient use of medicinal resources and the development of new medicinal resources.

Keywords： Angelicae Sinensis Radix； different medicinal parts； gray relational analysis； quality evaluation

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的根，始载于《神农本草经》，被列为中品，素有“十方九歸”的美誉，主产于甘肃，尤以甘肃岷县所产品质最优、疗效最佳、产量最高。当归有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效，主要用于血虚萎黄、

基金项目：国家自然科学基金地区基金（81360633）；甘肃省自然科学基金（1506RJZA044）；甘肃省中医药管理局科研课题（GZK-2016-25）

通讯作者：邓毅，E-mail：dengyi@gszy.edu.cn

眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、肠燥便秘等症[1]。我国历代医家在长期临床实践中得出“当归……头能破血，身能养血，尾能行血，用者不分，不如不使”（《汤液本草》）、“当归头，止血而上行；身养血而中守；梢破血而下流；全活血而不走”（《药性赋》）等药性理论[2]，以当归身养血补血、当归尾行血破血为功效的相关方剂收载也多见于各类典籍。

判断当归不同药用部位间差别的基本标准包括：主要化学成分当归多糖、阿魏酸等含量，药理、生化及生物分子细胞实验指标，以及配方后的临床疗效等指标[3]。有研究表明，当归不同药用部位不仅在外观性状、粉末性状、横切面组织结构等方面存在显著差异[4-5]，且在挥发油、阿魏酸、藁本内酯等主要化学成分的含量方面也存在一定差异[6-7]；药理学相关研究表明：当归所含的多糖成分是其发挥补血作用的主要有效成分，可以通过增加外周血白细胞、红细胞、血红蛋白等数量，改善机体造血功能[8-11]；阿魏酸为当归的有效成分之一，具有明显的扩张冠状动脉血管、增加冠脉流量、改善心肌缺血、抑制胶原和二磷酸腺苷诱导的血小板聚集等作用[12-13]，从而具有良好的活血功效。同时测定当归不同药用部位水煎液中当归多糖与阿魏酸含量的报道少见。本研究通过当归不同药用部位的理化检识及水煎液中主要化学成分含量测定，对当归不同药用部位进行系统研究，采用灰色关联度分析当归不同药用部位的质量，为当归的临床合理、高效使用提供依据。

1 仪器与试药

DJ-02型中药粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司），ME204E/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），HH-S型恒温水浴锅（金坛市环保仪器厂），RJM-28-10型马福炉（上海亚太仪表厂），SB-25-12-DT型超声波清洗器（宁波新芝生物科技有限公司），GZX-GF101-1-BS-II/H型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司），MH-1000型调温电热套（北京科伟永兴仪器有限公司），UV BlueStar B型紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科技仪器有限公司），Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司，检测器为G1315B DAD）。

当归购自甘肃省岷县清水乡，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李成义教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv）Diels的根，洁净干燥后严格按照2015年版《中华人民共和国药典》当归项下规定分为全当归、当归头、当归身、当归尾，存放于甘肃中医药大学理化实验室。葡萄糖对照品（批号S08J6G1）、阿魏酸对照品（批号R055F6F1），上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国默克公司），水为超纯水，甲酸、无水乙醇等试剂均为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）。

2 理化检识

2.1 总灰分测定

按照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2302项下规定进行检测[14]204。

2.2 酸不溶性灰分测定

按照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2302项下规定进行检测[14]204。

2.3 醇溶性浸出物含量测定

按照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2201项下热浸法进行检测[14]202。

3 主要化学成分含量测定

3.1 测定条件

采用分光光度法测定当归多糖含量。样品处理采用苯酚-硫酸法[15]，每1 mL供试品溶液加入5%苯酚1.5 mL、浓硫酸7.0 mL，沸水浴10 min后冷却至室温即可检测，检测波长为486 nm。

采用HPLC测定阿魏酸含量。色谱条件：色谱柱为Agilent A3000250×046 Pursuit 5 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A）为流动相，梯度洗脱（0～15 min，5%～15%B；15～25 min，15%～25%B；25～35 min，25%～35%B；35～40 min，35%～70%B；40～55 min，70%～95%B；55～60 min，95%～100%），检测波长为280 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样量20 ?L。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取经105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品10.20 mg，置100 mL量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，制成0.102 mg/mL葡萄糖对照品溶液，备用。

精密称取干燥至恒重的阿魏酸对照品4.98 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，制成0.099 6 mg/mL阿魏酸对照品溶液，备用。

3.3 供试品溶液的制备

精密称取全当归、当归头、当归身、当归尾粉末各10 g（过3号筛），加12倍量水，提取3次，提取时间2 h，浓缩各提取液至含原药材0.5 g/mL，冷却至室温后精密量取各提取液1 mL，转移至10 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，0.45 ?m微孔滤膜过滤，为阿魏酸供试品溶液，备用。剩余提取液加无水乙醇，使溶液最终含醇量为65%，置4 ℃冰箱中24 h充分沉淀，过滤，沉淀水浴加热挥至无醇味后分别用乙醚、丙酮洗涤，50 ℃干燥至恒重，置100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，为当归多糖供试品溶液，备用。

3.4 标准曲线的绘制

精密吸取葡萄糖对照品溶液（0.102 mg/mL）0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度。分别吸取1.0 mL至干燥潔净试管中，依次加入5%苯酚1.5 mL、浓硫酸7.0 mL，混匀，沸水浴30 min，冷却至室温后，以第一管为空白对照，于486 nm波长处测定吸光度（A），以葡萄糖质量浓度（C）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，葡萄糖在0.010 2～0.102 mg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：A=11.360C-0.004 0，r=0.999 6。

精密吸取阿魏酸对照品溶液（0.099 6 mg/mL）5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 ?L，按“3.1”项下色谱条件进行含量测定，以阿魏酸质量浓度（C）为横坐标，峰面积（T）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，阿魏酸在0.498～2.988 ?g/mL范围内线性关系良好，回归方程为：T=2763C+30.65，r=1。

3.5 方法学考察

3.5.1 稳定性试验

精密量取葡萄糖对照品溶液和当归多糖供试品溶液各1.0 mL，按“3.1”项下当归多糖测定方法操作，在486 nm波长处测定吸光度，前60 min每隔10 min测定1次，后60 min每隔20 min测定1次，结果葡萄糖对照品溶液吸光度值RSD=0.51%，当归多糖供试品溶液吸光度值RSD=0.62%，表明葡萄糖对照品溶液及当归多糖供试品溶液在120 min内保持稳定。

精密吸取阿魏酸对照品溶液和阿魏酸供试品溶液各20 ?L，分别于0、1、2、4、8、12、24 h进样，结果相对峰面积RSD=1.23%，表明稳定性良好。

3.5.2 精密度试验

精密吸取葡萄糖对照品溶液1 mL，共6份，在486 nm波长处测其吸光度，RSD=1.9%，结果表明精密度良好。

精密吸取阿魏酸对照品溶液20 ?L，在“3.1”项色谱条件下连续进样6次，相对峰面积RSD=0.27%，表明精密度良好。

3.5.3 加样回收率试验

称取等量全当归粉末各5份，分别加入一定质量的葡萄糖对照品，按“3.3”项下方法制备葡萄糖供试品溶液，并按“3.1”项下条件测定，结果平均加样回收率为101.21%，RSD=1.96%。

稱取全当归粉末3.00 g各5份，分别加入一定质量的阿魏酸对照品，按“3.3”项下方法制备阿魏酸供试品溶液，并按“3.1”项下条件测定，结果平均加样回收率为98.71%，RSD=1.23%。

3.6 样品测定

精密量取1 mL当归多糖供试品备用液，转移至10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，按“3.1”项下当归多糖测定条件操作，测定其吸光度。

分别精密吸取全当归、当归头、当归身、当归尾的阿魏酸供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行测定，进样量20 ?L，各样品溶液HPLC图谱中阿魏酸的保留时间基本一致，均为20 min左右。根据阿魏酸成分的峰面积计算阿魏酸含量。

注：D1.阿魏酸对照品；D2.全当归；D3.当归头；D4.当归身；D5.当归尾

图1 当归不同药用部位水煎液HPLC图

4 评价当归及其不同药用部位质量灰色关联度模式的建立

4.1 灰色关联度法的建立

4.1.1 参考序列的选择

设有m个药材样品，每个药材样品有n项评价指标，则可组成评价单元序列{Xak}（a=1，2，3，…，m；k=1，2，3，…，n；本研究中m=4，n=5）。从质量评价角度分析，醇浸出物、当归多糖、阿魏酸含量越高质量越好，灰分、酸不溶性灰分含量越低质量越好。为了统一评价标准，采用将低样品对应优指标高优化的方法[16]。用灰色关联度作为评价测度时，试验将总灰分和酸不溶性灰分含量进行取倒数转换。评价指标统一后，设最优参考序列的各项指标是n个指标的最大值，记为{Xsk}=max{1≤s≤m}{Xik}，最差参考序列的各项指标是m个样品对应指标的最小值，记为{Xtk}=min{l≤t≤m}{Xik}。

4.1.2 原始数据规格化处理

如果原始数据量纲不统一，则需要对原始数据进行变换处理。以均值化变换最常用，公式为：Yik=Xik/Yk（Yik为规格化处理后的数据，Xik为原始数据，Yk为第m个样品的第k个指标的均值）[17]。

4.1.3 关联度计算

用灰色关联度进行评价时，应选择其参考序列。最优参考序列和最差参考序列分别为{Xsk}和{Xtk}（k=1，2，3，…，n）。设最优参考序列的各项指标是n个样品对应指标的最大值，即{Xsk}；最差参考序列的各项指标是n个样品对应指标的最小值，即{Xtk}。按公式（1）（2）计算各评价单元序列相对最优（差）参考序列的关联系数。按公式（3）（4）计算各评价单元相对于最优（差）参考序列的关联度。

ε_k（s）^i=（Δmin+ρΔmax）/（|Y_ik-Y_sk |+ρΔmax）（1）

ε_k（t）^i=（Δ^' min+ρΔ^' max）/（|Y_ik-Y_sk |+ρΔ^' max）（2）

（3）

（4）

4.1.4 相对关联度的计算

如果评价单元与最优参考序列关联程度最大而同时与最差参考序列的关联程度最小，则说明所评价的序列越理想，为最佳评价单元。由此将评价单元序列同时相对于最优参考序列和最差参考序列的相对关联度定义为公式（5），根据相对关联度的大小对评价单元序列进行排序，最终得到评价结果。

（5）

4.2 样品数据的建立

测定当归及其不同药用部位的总灰分和酸不溶性灰分、醇浸出物、当归多糖、阿魏酸含量5个主要评价指标，计算各成分的百分含量，建立评价当归及其不同药用部位质量的灰色模式识别数据集，结果见表1、表2。将原始数据集进行规格化处理，结果见表3。分别由公式（1）（2）（3）（4）计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联系数及关联度，结果见表4～表7。由公式（5）计算当归及其不同药用部位样品的相对关联度并排序，得出不同部位的质量名次，结果见表8。

4.3 当归及其不同药用部位药材质量评价

相对关联度越大，该样品的质量评价越高，当归及其不同药用部位药材样品的相对关联度介于0.435～0.576。其中相对关联度>0.50的为当归尾、全当归，其药材质量评价较高；当归头、当归身的相对关联度<0.50，质量评价较低。各样品质量评价依次为当归尾>全当归>当归身>当归头，当归尾样品中指标相对关联度最大（0.576），质量评价最优，其次为全当归样品（0.505），当归头相对关联度最小（0.435），其质量评价较差。

5 讨论

本研究首先对当归及其不同药用部位进行总灰分、酸不溶性灰分及浸出物的检测，结果表明，所选样品均符合《中华人民共和国药典》要求。灰分及酸不溶灰分含量依次为：当归尾>全当归>当归身>当归头；浸出物含量依次为：当归头>当归尾>当归身>全当归，当归不同部位醇溶性浸出物含量明显高于全当归，这种量的变化对于当归不同提取部位的研究有重大意义。同时测定了当归及其不同药用部位水煎液中当归多糖、阿魏酸的含量，结果表明：当归多糖含量以当归身显著高于其他部位；而阿魏酸含量则以当归尾显著高于其他部位。结合上述当归多糖为当归补血的主要物质基础、阿魏酸为当归活血的主要物质基础，表明当归“身养血，尾行血，全能补血活血”的药性理论古今一致，且与文献中描述的组织形态鉴定结果相吻合[18]。

目前多用显微模式识别、化学指纹图谱、化学计量法等方法评价中药材的质量。当归作为一种传统中药材，具有化学成分复杂、成分与质量有一定模糊性等特点，可视为一个灰色系统。本试验建立的灰色關联度模型，以总灰分及酸不溶性灰分含量的倒数、醇溶性浸出物含量、水煎液当归多糖含量、水煎液阿魏酸含量为参评项目，以相对关联度为评价指标，对当归及其不同药用部位药材质量实现了多成分、多指标的优劣评价，与建立在多元统计分析基础上的统计模式识别相比，具有较大的优越性，能够客观地反映不同药用部位的内在质量，可为当归不同药用部位的质量评价提供新思路。

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