微乳毛细管电动色谱法检测黄酒中邻苯二甲酸酯类增塑剂

黄 琦，季晓娟，徐立锋

(1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州310023;2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州310023)

邻苯二甲酸酯类(phthalate acid esters，PAEs)增塑剂广泛应用于塑料工业，普遍存在于食品包装材料、玩具、医用血袋和胶管、个人护理用品等数百种产品中，对人体的健康有严重的危害。研究表明，PAEs又是一类环境激素，有类似雌性激素的作用，长期接触可干扰内分泌，尤其对于男性，可造成生殖问题［1-3］。PAEs比较容易迁移到环境中，可通过食品包装材料迁移到食品中而被人体吸收。近年来，对于邻苯二甲酸酯类产生的危害时有报道［4］，欧盟、美国、中国等国家和地区都制定了限制PAEs使用的法律法规。

黄酒是中国古老传统酒种之一，浙江省黄酒尤其是绍兴黄酒在国内外久负盛名。近年来，黄酒中邻苯二甲酸酯类增塑剂超标问题日益引起关注。黄酒中乙醇含量较高，而乙醇对PAEs有良好的溶解能力，在黄酒与塑料制品如塑料容器、塑料内盖、塑料接酒桶等的接触过程中PAEs有迁移到黄酒中的风险。黄酒中 PAEs的测定方法大多采用 GC-MS 法［5-8］、HPLC 法［9-10］、UPLC 法［11-12］等，这些方法对仪器要求比较高，而采用微乳毛细管电动色谱法(MEEKC)测定黄酒中PAEs鲜有报道。因此，本研究在经典微乳体系基础上加入有机添加剂乙腈，可分离并同时测定12种邻苯二甲酸酯类增塑剂，将其应用于黄酒中PAEs的检查。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:SQ-Agilent 7100高效毛细管电泳仪(美国Agilent公司);未涂层熔融石英毛细管:65.2 cm×75 μm，有效长度57.5 cm(河北永年锐沣色谱器件有限公司);Oasis HLB Glass柱(6 mL/200 mg，美国Waters公司);旋转蒸发器(上海予捷仪器有限公司)。

试剂:邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于96%;SDS(纯度＞98%)，美国Sigma公司;正己烷(色谱纯)，美国Sigma公司。试验用水为三次重蒸水;试验过程避免接触塑料容器;黄酒样品购自本地超市。

1.2 溶液的制备

1.2.1 微乳液的制备

缓冲溶液pH值用1 mol/L NaOH和1 mol/L H3PO4溶液调节。取SDS、正丁醇、有机添加剂和油相溶于缓冲液，超声混合30 min。

1.2.2 标准溶液

准确量取12种邻苯二甲酸酯标准溶液，用微乳缓冲溶液超声溶解，定容至100 mL，低温保存。

1.2.3 样品的提取、净化

参考文献［12］，准确称取5.00 g黄酒样品置25 mL烧杯中，加水稀释，使乙醇体积分数小于5%。将稀释液加入活化后的Oasis HLB Glass柱，控制流速1 mL/min，用5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，待淋洗液流干，用5 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，超声溶解于微乳缓冲溶液，定容至 1.0 mL，经0.45μm滤膜过滤，待进样分析。

1.3 试验方法

试验前分别用0.5 mol/L NaOH、水和缓冲溶液冲洗毛细管5 min，2次运行之间按上述条件重复冲洗。分离电压20 kV，进样时间6 s，进样压力5.0 kPa，温度20℃，检测波长230 nm。

2 结果与讨论

2.1 微乳体系的组成

MEEKC中经典的微乳体系由质量浓度为33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷和体积分数为89.3%的10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为8.5)组成［13］。pH值会影响分离度，有机添加剂能明显改善分离选择性，而SDS浓度和水相电解质浓度会对分离时间产生影响［14］。在12种邻苯二甲酸酯类增塑剂中，DIBP、BBP、DBEP和DBP 4种增塑剂较难分离。因此，本试验以经典微乳体系作为研究起点，对影响结构相近物分离的因素进行优化，使12种邻苯二甲酸酯类增塑剂得以分离。

2.1.1 缓冲液体积分数

在2～10 mmol/L范围内，随着磷酸盐体积分数的增加，12种PAEs的分离度有所改善，工作电流有所增大，但迁移时间没有明显变化。为减少工作电流，选择6 mmol/L的磷酸盐-硼砂缓冲液。

2.1.2 pH 值

pH值对12种PAEs分离度的影响见图1。由图1可知，12种PAEs的迁移时间随着pH值的增大而有所增加，相邻PAEs的分离度有所改善。在pH值为9.0时，12种PAEs均能获得较好峰形和适宜的分离时间。综合考虑分离度、灵敏度和适宜的出峰时间，选择pH值为9.0。

图1 pH值对分离的影响Fig.1 Effect of pH values on separation

2.1.3 SDS 质量浓度

SDS对形成稳定均一的微乳液是非常重要的，并可影响分离的效果。当SDS质量浓度过高时，电泳的电流会产生较大的焦耳热，工作电流也随之增加;当SDS质量浓度降到20 mg/mL时，微乳液会变浑浊，导致分离体系不稳定。结合分析时间和分离效率，仍采用质量浓度为33.1 mg/mL的SDS。

2.1.4 有机添加剂的影响

体积分数为20%以内的乙腈和甲醇常作为MEEKC的有机添加剂［14］。有机添加剂可以改变被分析物在油相和水相的分配系数，增加时间窗口、改善峰形、提高柱效。对较难分离的 DIBP、BBP、DBEP和DBP，添加乙腈后可明显改善分离度。由图2可知，不同乙腈体积分数(4%、8%、12%、16%)对4种PAEs的分离有明显改善，综合考虑出峰时间和分离度，本试验选择添加体积分数为12%的乙腈。

图2 乙腈体积分数对4种PAEs分离的影响Fig.2 Effect of acetonitrile volume fraction on separation of 4 PAEs

2.1.5 电泳条件

电压在15～30 kV范围内，随着电压的升高，12种PAEs的迁移时间会减少，高电压会引起焦耳热问题，因此，选择分离电压20 kV。当分离温度为20℃时，能获得较好的重现性。

2.1.6 MEEKC 分离条件

通过对各因素的考察，最终确定的微乳体系为:质量浓度为33.1 mg/mL的SDS、66.1 mg/mL的正丁醇、8.1 mg/mL的正辛烷，体积分数为12%的乙腈、77.3%的6 mmol/L磷酸盐-硼砂缓冲液(pH值为9.0)。分离电压20 kV，分离温度20℃，检测波长230 nm。在该色谱条件下，12种PAEs标准混合液微乳毛细管电动色谱分离谱图见图3，较难分离的DIBP、BBP、DBEP和DBP达到基线分离。空白黄酒样品在12种PAEs的出峰时间范围内无干扰，检出PAEs的黄酒样品谱图见图4。

图3 12种PAEs标准混合液的分离谱图Fig.3 Electropherogram of 12 PAEs by MEEKC

图4 检出PAEs的黄酒样品的微乳电动色谱分离谱图Fig.4 Electropherogram of PAEs in rice wine sample by MEEKC

2.2 样品的提取、净化

黄酒中乙醇含量较高，对PAEs的溶解性较好，需要先降低样品中酒精含量，清除基质中的氨基酸等干扰物。本研究采用文献［12］的固相提取方法对黄酒样品提取、净化，检测时样品对12种PAEs无干扰。

2.3 线性范围和检出限

采用外标定量法，得到12种 PAEs的线性回归方程和检出限(LOD，S/N=3)，结果见表1。GB 9685—2008《食品容器、包装材料用添加剂使用标准》规定食品容器、包装材料的添加剂中，DBP迁移到食品中的最大量不得超过0.3 mg/kg，DEHP迁移到食品中的最大量不得超过1.5 mg/kg［15］，分别相当于1.5μg/mL和7.5μg/mL，高于该方法的检出限，因此该方法满足我国卫生部对食品、食品添加剂中PAEs的最大残留量检测要求。

表1 校准曲线、线性范围和检出限Table 1 Calibration curve，linear range and LOD

表1 (续)

2.4 重现性

PAEs混合标准溶液(100μg/mL)的日内和日间精密度测定结果见表2，12种PAEs的迁移时间和峰面积重现性良好。

表2 方法重现性(n=6)Table 2 Reproducibility(n=6)%

2.5 加标回收率试验

对不含PAEs的黄酒样品，测定其分别在10、200μg/mL的添标水平下的加标回收率，结果见表3。

表3 方法回收率和精密度(n=6)Table 3 Recovery and precision rates(n=6) %

2.6 样品的检测

对市场上10种黄酒品牌(每种品牌6批)测定，有1个品牌样品检出DMP、DEP、DIBP、DBP和DEHP 5种PAEs，有1个品牌样品检出DMP、DBP和DEHP等3种PAEs，有2个品牌样品检出DIBP和DEHP等2种PAEs，其余品牌中未检出PAEs。

3 结论

本研究在常用微乳毛细管电动色谱的微乳体系中添加乙腈，可使2种PAEs达到基线分离。试验所用仪器易于普及，试验所用试剂环境友好。本研究所建立的MEEKC方法能检测黄酒中的12种PAEs，方法检测限低至0.5μg/mL，精密度和准确度良好，能满足黄酒样品中常见PAEs的限量检测要求。

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