一株引起番茄果腐病病原菌的分离鉴定

桑 雪， 刘 阳， 王 锐 银， 侯 红 漫， 高 美 玲

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.广州联合生物技术有限公司， 广东 广州 510663 )

0 引 言

灰霉菌(Botrytiscinerea)，又称灰葡萄孢霉菌，属半知菌纲(Deuteromycetes)、从梗孢目(Moniliales)，是一种广寄主性、能够引起多种植物烂果现象的致病菌。灰霉菌能够侵染200多种植物[1-2]，冬季温室环境下容易引发，给植物的采后阶段造成巨大损失[3-4]，迄今未发现有植物对其产生抗性。

番茄灰霉病是世界性的重要病害之一，对番茄产量的影响极大，严重时可致减产40%以上[5]。番茄灰霉病较难防治，主要是由于目前在番茄中还未发现灰霉病的直接抗原材料，且缺乏一定的分子鉴定基础。

实验采集大棚中的番茄病果，从中分离纯化得到菌株BC1402，通过柯赫式法则[6]及分子生物学方法进行鉴定，以期为建立快速、灵敏的番茄病早期诊断方法提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

番茄病果采自辽宁大连地区商业温室大棚。

水琼脂培养基：琼脂粉20 g/L，蒸馏水；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L；马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L；LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠5 g/L。以上培养基配制后121 ℃高压灭菌20 min，晾凉后放置4 ℃备用。

凝胶成像分析系统，美国伯乐公司；PCR扩增仪，美国伯乐公司；电泳仪，大连捷迈科技贸易有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 形态学鉴定

菌株的分离纯化基于常规方法并稍作修改[7]。将病症明显的番茄果病叶在70%乙醇中浸泡30 s后，在2%的次氯酸钠溶液浸泡1.5 min，用无菌水冲洗3次。用无菌手术刀片切去病症处组织，接种到水琼脂培养基上，20 ℃培养1～2 d，将真菌菌落转移到PDA培养基中培养1～2 d；将真菌菌落挑出至PDB培养基中，继续培养1～2 d；单孢挑出至加入0.1%氨苄西林钠的PDA培养基中培养3～4 d，放到4 ℃冰箱保藏备用。

1.2.2 致病力鉴定

致病性鉴定所用植物均是温室中在装有无菌土壤的塑料罐(直径20 cm，高度14 cm)中独立生长的2个月大的健康番茄。

根据柯赫氏法则，本实验选用24株相同年龄、相同培养条件下的番茄植物，分两组(每组12株)，一组的叶和茎用PDA培养基上生长的2×105CFU/mL 的菌落悬浮液喷洒，20 ℃黑暗条件下培养。另一组作为对照，用无菌水进行喷洒。从接种的感染组织中重新分离出真菌，并将其形态特征与原始分离的菌株的形态特征进行比较，实验重复3次[8]。

1.2.3 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取菌株总DNA[9]。PCR扩增后纯化、连接及测序。rDNA-ITS扩增采用通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)。PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，根据上、下游引物之间DNA片段的大小，使用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒进行琼脂糖凝胶回收纯化，连接载体过夜、转化、蓝白斑筛选。将选取的阳性克隆菌液于LB培养基中培养过夜，送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测得序列与NCBI数据库进行序列同一性比较，取相似度最高的15个序列和测定序列用Mega 6.0软件分析，自展数据集为1 000，采用邻位相连算法[10]，经Consensus程序计算多数一致树，构建系统进化树[11]。

2 结果与讨论

2.1 形态学鉴定

BC1402菌在PDA培养基中生长迅速，产生空气菌丝体，7 d后变成棉白色，如图1所示。

图1 培养7 d的BC1402菌落

用400倍光学显微镜观察7日龄的菌丝形态。菌单孢梗较长，数根丛生，淡褐色，顶端呈1～2次分枝，产生大量分生孢子(图2)；分生孢子形状为圆形或椭圆形，大多数呈淡灰褐色，表面光滑且大小在(8.52～15.98) μm×(6.33～10.11) μm (图3)。结果与魏景超[7]和张中义[12]的实验结果进行比对，结合病害症状及其形态，初步鉴定该菌为葡萄孢属(Botrytis)。

2.2 致病力鉴定

如图4所示，番茄植株接种BC1402菌株4 d后，番茄的叶片和茎部发黄褐色、干软枯萎，而对照组未发病。从接种BC1402菌种感染组织中重新分离出菌株，并将其形态特征与原始分离的菌株进行比较，结果一致，证明BC1402菌株为番茄果实的致病菌，符合柯赫式法则。

图2 显微镜下PDB培养基上形成的菌丝和分生孢子

Fig.2 The hyphae and conidia formed on PDB medium under the microscope

图3 显微镜下PDA培养基上形成的分生孢子

图4 BC1402致病力鉴定

2.3 菌株DNA纯度检测及rDNA-ITS序列PCR克隆

采用CTAB法提取BC1402菌株的总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。经紫外分光光度计测定，OD260/OD280为1.83，符合DNA提取的纯度要求。以此DNA为模板，通过PCR扩增，得到长度约为600 bp的片段，如图6所示。纯化回收目标DNA片段与载体连接并进行测序，测序得到rDNA-ITS序列长度为515 bp。

图5 BC1402菌株总DNA电泳图

图6 rDNA-ITS PCR扩增电泳图

2.4 系统发育树分析

将BC1402菌株的rDNA-ITS序列与GenBank数据库进行Blast比对分析，结果表明BC1402菌株与灰葡萄孢霉菌序列一致。取15个相似度最高菌株的rDNA-ITS序列与BC1402序列构建系统发育树，如图7所示。该菌株与Botrytiscinereastrain ASU3 (KR811363.1)的同源性最高，可以证明BC1402菌株为灰葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)。

3 结 论

从番茄病果上分离纯化得到病原菌株BC1402，通过形态学鉴定,依据柯赫式法则测试致病力，并结合rDNA-ITS序列分析，构建系统发育树，结果均证实了引起番茄果腐病的病原菌即为灰葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)。

参考文献:

[1] PRINA T W, TUDZYNSKI P, von TIEDEMANN A. Infection stragesties ofBotrytiscinereaand related necrotrophic pathogens[M]//Fungal Pathology. 2th ed. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2000.

[2] 崔志婧.灰霉菌产孢类群的划分及其遗传多态性分析[D].上海:华东师范大学,2012.

[3] 李保聚,朱国仁．番茄灰霉病发展症状诊断及综合防治[J].植物保护,1998,24(6):18-20.

[4] 吕佩珂.中国蔬菜病虫原色图谱(无公害新版)[M].北京:学苑出版社,2004.

[5] 王瑞虎,关鑫,陈秀玲,等.番茄灰霉病菌的鉴定及系统发育树分析[J].北方园艺,2013(6):127-131.

[6] 庞莉.棉花黄萎病菌的快速分子检测技术研究[D].北京:中国农业科学院,2015.

[7] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.

[8] GAO M L, LUAN Y S , YU H N, et al. First report of tomato leaf spot caused byFusariumproliferatumin China[J]. Canadian Journal Plant Pathology, 2016, 38(3): 400-404.

[9] LEE S B, TAYLOR J W. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores[M]. New York: Academic Press, 1990.

[10] SAITOU N, NEI M. The neighbor-joining method for reconstructing trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425.

[11] KIMURA M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution, 1980, 16: 111-120.

[12] 张忠义.中国真菌志[M].北京:科学出版社,2003.