鸡血藤组方提取物的抗肿瘤作用及其机制初探

唐旗羚 曹颖男 徐娟娟 王有娣 贺 彦 郑江洋 温梓媚 张素中*

（中山大学新华学院，广东 广州 510520）

肿瘤是机体局部组织细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成。现有化疗药物虽然抗癌作用确切，疗效显著，但也存在严重不良反应、长期应用易产生肿瘤多重耐药性的缺陷。而中药复方可以免疫调节为基础，逆转肿瘤免疫逃逸，改善机体功能，抑制肿瘤生长。已有研究表明鸡血藤、柴胡、蜈蚣、半夏等中药材能够明显抑制肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤组织生长，其中蜈蚣提取物可显著阻滞宫颈癌细胞周期[1-7]，厚朴酚对人小细胞肺癌细胞具有诱导凋亡作用[8]。本文基于已有研究将鸡血藤、厚朴、柴胡、生半夏、蜈蚣进行组方并提取，探索该组方提取物的抗肿瘤作用，并对其机制进行初步研究，为后续药理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞、鼻咽癌CNE-2Z细胞、骨肉瘤143B细胞、急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞。

1.1.2 仪器与试剂：CCK-8试剂、二甲基亚砜、RPMI-1640培养基、IMDM培养基、胰酶、胎牛血清、倒置荧光显微镜、Hoechst 33258荧光染色检测试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法测定鸡血藤组方提取物对各肿瘤细胞增殖作用的影响：收集对数生长期的HepG2、A549、143B、CNE-2Z、HL-60细胞，接种于96孔板，每孔加90 μL的细胞悬液，在37 ℃条件下孵育。每孔对应加入0.0044～17.00 mg/mL不同梯度浓度的鸡血藤组方提取物10 μL，置于37 ℃培养箱中孵育72 h，同时设立阴性对照组和空白对照组。加入100 μL含10% CCK-8的培养基置于37 ℃培养箱中孵育，酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度（A）值。采用Graph Pad Prism 5软件分析鸡血藤组方提取物在72 h的IC50值并作图。肿瘤细胞生长抑制率%＝[（受试物吸光度值-阴性对照吸光度值）/（阴性对照吸光度值-空白对照吸光度值）]×100%。

1.2.2 Hoechst33258染色法观察HepG2细胞核的形态学变化：取对数生长期的HepG2细胞，以每孔500 μL的体积接种于24孔培养板中，细胞贴壁后加入0.459 mg/mL浓度的鸡血藤组方提取物，置于37 ℃培养箱中孵育48 h，4%的多聚甲醛液固定。PBS洗涤。加入Hoechest 33258染色液500 μL，室温避光染色后PBS洗涤，避光风干，倒置荧光显微镜观察拍照。

2 结 果

2.1 鸡血藤组方提取物对各肿瘤细胞增殖作用的影响：CCK-8法测定结果显示，与空白对照相比，经各浓度鸡血藤组方提取物作用后的肝癌HepG2细胞、肺癌A549细胞、鼻咽癌CNE-2Z细胞、骨肉瘤143B细胞、急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞，其增殖均受到不同程度的抑制，并且鸡血藤组方提取物对上述5种细胞增殖的抑制作用呈现一定的浓度依赖性，见图1。经Graphpad Prism 5软件分析，鸡血藤组方提取物干预HepG2、A549、CNE-2Z、143B、HL-60细胞72 h的IC50值分别为0.54、10.04、1.59、0.86、3.37mg/mL，最大抑制率分别为92.06%、98.74%、99.99%、97.44%、77.78%，见表1。

2.2 鸡血藤组方提取物对HepG2细胞凋亡形态学变化的影响：Hoechst 33258细胞核染色结果显示，空白对照组HepG2细胞多数呈现染色质均匀分布等活细胞特征。与空白对照组相比，鸡血藤组方提取物作用48 h的HepG2细胞，其凋亡细胞数明显增多，呈现染色质凝集、核浓染等典型特征，提示鸡血藤组方提取物可诱导HepG2细胞凋亡，见图2。

图1 鸡血藤组方提取物对各肿瘤细胞株增殖抑制作用的IC50值

表1 不同浓度鸡血藤组方提取物对不同肿瘤细胞增殖的影响

图2 Hoechst 33258染色观察细胞核的形态学变化

3 讨 论

在肿瘤的中医治疗中，常用的治疗法有扶正培本法、清热解毒法、活血化瘀法、利湿逐水法、软坚散结法等[9]。本文鸡血藤、厚朴、柴胡、生半夏、蜈蚣组方中药材具有疏肝理气、解毒散结作用而产生扶正抗癌作用，研究结果表明该组方提取物在体外对肝癌HepG2细胞 、肺癌A549细胞、鼻咽癌CNE-2Z细胞、骨肉瘤143B细胞以及急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞均产生具有浓度依赖性的抑制增殖作用，Hoechst 33258染色结果提示这可能与该组方提取物促进肿瘤细胞凋亡相关。已有研究表明，中草药及中药复方通过调控多重药耐药基因蛋白的表达，产生有效逆转肿瘤多重耐药的作用，可开发为肿瘤多重耐药基因MDR的逆转剂，现已成为研究热点[10]。李冬梅[11]的研究显示，扶正解毒中药复方可以逆转乳腺癌多药耐药的基因表达，改善患者免疫功能，提高化疗疗效。P-糖蛋白是多重耐药基因MDR1的蛋白产物，通过消耗ATP将药物从肿瘤细胞外排，减少肿瘤细胞内有效药物浓度，从而导致严重的肿瘤多药耐药。基于本文已研究鸡血藤组方的抗肿瘤作用及机制，可进一步研究其对MDR基因及其相关蛋白产物表达的影响，以期为中药组方在肿瘤治疗领域发挥重要作用提供理论基础。

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