Thoc1真核表达载体构建及其与ClC-3蛋白在人宫颈癌细胞HeLa中的共定位观察

刘学强，郑兆广，王汝上，钟杰，何桂芳，徐彬(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广州50006；广州康臣药业有限公司肾病药物研究中心)

人类Thoc1蛋白是酵母转录蛋白1的一种功能性同源物[1]，能够结合视网膜母细胞瘤基因1的氨基末端结构域。Thoc1可调节转录延伸，与RNA聚合酶Ⅱ及RNA转录因子紧密联系[2]。癌细胞需要比正常细胞更高的Thoc1水平以维持生理活动[3]，肿瘤组织中Thoc1表达水平也显著高于正常组织[4]。氯离子通道3(ClC-3)是正常细胞生长和增殖必不可少的，在细胞周期调控、细胞凋亡、细胞黏附和细胞运动等方面均发挥重要作用[5]。ClC-3可调控细胞周期蛋白表达，其表达水平及在细胞中的分布均呈细胞周期依赖性，但其是否参与细胞转录过程目前鲜见报道。2017年1～10月，本研究克隆人Thoc1基因并构建pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体，通过体外转染和免疫荧光技术观察Thoc1和ClC-3在人宫颈癌细胞HeLa中的表达及共定位情况，探讨ClC-3是否参与了细胞转录过程。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌DH5α、人宫颈癌细胞HeLa和乳腺癌细胞株MCF-7为广东药科大学生命科学与生物制药学院细胞实验室保存；pDsRed2-N1载体为Clontech公司产品。限制性内切酶SacⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 聚合酶均购自NEB(北京)公司；LA Taq酶购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司；总RNA提取试剂TRIzol和转染试剂Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自美津生物科技有限公司；Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG购自碧云天生物技术研究所；小鼠抗人ClC-3单抗购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养 将MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰岛素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，HeLa细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中。两种细胞均置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，取对数生长期细胞进行以下实验。

1.3 Thoc1基因克隆 ①Thoc1引物设计和合成。在GenBank检索人Thoc1基因核苷酸序列，基因登录号NM_005131.2，设计Thoc1引物并由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物：5′-GCGCGAGCTCATGTCTCCGACGCCGCCGCT-3′，下游引物：5′-GCGCGGATCCATACTATTTGTCTCATTGTCAT-3′， 上、下游引物分别含SacⅠ和BamHⅠ酶切位点，产物2 092 bp。②Thoc1基因扩增。收集对数生长期的MCF-7细胞，按TRIzol试剂和反转录试剂盒说明书提取细胞总RNA，并将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用Thoc1引物和LA Taq酶进行PCR反应。PCR反应体系50 μL：模板cDNA 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL， LA Taq(5 U/μL) 0.5 μL，2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mix 8 μL，ddH2O 12 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，完成30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后在0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察并鉴定扩增的DNA片段，进行切胶回收。结果显示得到的产物只有1条亮带，位于约2 000 bp的位置，其分子量大小与理论预期大小2 092 bp相符。见图1。

注：M为1 kb DNA分子量标准；1为Thoc1基因的PCR产物

图1Thoc1基因的PCR扩增结果

1.4 pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体的构建及鉴定 内切酶SacⅠ和BamHⅠ双酶切PCR产物和质粒pDsRed2-N1，回收Thoc1和pDsRed2-N1线性化载体片段。加入T4 DNA连接酶，于16 ℃条件下连接过夜，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，37 ℃条件下培养16 h，随机取其中4个克隆进行菌落PCR鉴定。将需经PCR鉴定的单克隆菌落接种于LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，内切酶SacⅠ和BamHⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳。酶切鉴定正确的菌落送华大基因进行测序鉴定，获得pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体。

1.5 HeLa细胞Thoc1基因表达检测 采用脂质体转染法。收集对数生长期HeLa细胞，调整细胞密度为1×105/mL，按1 mL/孔接种于24孔细胞培养板。待细胞融合至70%～80%时，将细胞随机分为转染组、空转染组及空白对照组，三组分别采用Lipofectamine 2000转染pThoc1-DsRed2-N1质粒、pDsRed2-N1质粒及脂质体。转染48 h，倒置荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达情况并进行拍照。

1.6 HeLa细胞Thoc1和ClC-3共定位观察 采用免疫荧光技术。转染组转染24 h，收集细胞，按1.5×104/孔接种于预先置有圆形盖玻片的48孔板中，培养24 h。PBS洗掉未贴壁的细胞，免疫染色固定液于室温固定15 min，封闭液封闭1 h；加入兔抗人ClC-3多克隆抗体，4 ℃反应过夜，加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG，室温避光反应1 h；细胞核染色液DAPI室温避光染色5 min，滴加抗荧光淬灭封片液，指甲油封固，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。绿色荧光表示ClC-3阳性表达，蓝色荧光表示细胞核，红色荧光表示Thoc1阳性表达。将绿色荧光和红色荧光进行叠加，如果两者存在共定位，则红色和绿色重合在一起，显示为黄色。

2 结果

2.1 pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体的鉴定结果 4个单克隆菌落PCR鉴定结果均显示在约2.1 kb处有一亮带，提示均为阳性克隆菌落(图2A)。pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体经SacⅠ和BamHⅠ双酶切得到约4.7 kb和2.1 kb的两个片段(图2B)，符合预期大小，证实Thoc1 cDNA成功插入到pDsRed2-N1真核表达载体中。基因测序结果显示，阳性克隆与Genebank中Thoc1基因序列完全一致(图2C)，证实成功构建pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体。

2.2 HeLa细胞Thoc1基因表达结果 空转染组可观察到较强的红色荧光，空白对照组没有观察到红色荧光，转染组红色荧光强度介于空转染组与空白对照组之间；证实HeLa细胞中存在Thoc1表达。

2.3 HeLa细胞Thoc1和ClC-3共定位观察结果 ClC-3分布于细胞核和细胞质中，主要是细胞核中；Thoc1只分布于细胞核中。两者叠加后在细胞核呈黄色荧光，证实ClC-3和Thoc1在HeLa细胞核上存在共同定位。

3 讨论

Thoc1是转录输出复合物的重要组成部分，在正常组织中调节转录延伸[2]和信号转导[6]，在胚胎早期发育过程中扮演重要角色[7]。癌细胞独特的基因表达需要Thoc1核糖核酸蛋白支持，癌细胞的侵略性表型和不良预后普遍与Thoc1高表达相关[8]。因此，Thoc1有可能成为治疗癌症的一个潜在分子靶点。但也有部分肺癌细胞(SPC-A1和NCI-H1975)微量表达Thoc1，这些肺癌细胞经过质粒转染提高Thoc1表达后可诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而抑制肺癌细胞生长[9]。因此，Thoc1在正常细胞和癌细胞以及不同组织来源癌细胞中的表达、功能均可能存在明显差异。

A为单克隆菌落PCR鉴定结果。M表示1 kb DNA 分子量标准；1～4表示1～4号单克隆菌落。B为双酶切鉴定结果。M表示1 kb DNA 分子量标准；1表示SacⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定结果(两个片段约4.7、2.1 kb)。C为阳性克隆的测序鉴定结果(因序列过长，此处仅显示从起始密码的部分结果)。

图2pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体的鉴定结果

ClC-3是电压门控氯离子通道的一个亚型，参与多种重要的细胞生理过程，如细胞生长、增殖、分化和迁移[10]，与癌症病灶的恶化扩大、侵袭、转移等密切相关。ClC-3在多种肿瘤组织中高表达。Hermoso等[11]发现，ClC-3在宫颈癌的发生过程中具有重要作用。ClC-3可增强癌细胞的耐药性[5]，促进与肿瘤转移相关的细胞膜皱褶形成，在肿瘤转移过程中发挥重要作用[12]。因此，ClC-3可能是与肿瘤的发生、发展及转移过程密切相关的关键分子之一。ClC-3参与多种细胞生理活动，但其是否参与了细胞转录目前尚未明确。

pDsRed2-N1载体是以红色荧光蛋白为报告基因的一种真核表达载体[13]。本课题组将携带起始密码而不带终止密码的Thoc1编码序列克隆到pDsRed2-N1的多克隆位点中，Thoc1 cDNA 序列与 RFP编码序列形成融合基因，经测序证实无读码框移位，因此这种N端融合的蛋白可以不改变天然RFP 的荧光性质[14]，指示Thoc1蛋白表达和定位[15]。本研究构建pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体，并通过PCR、SacⅠ和BamHⅠ双酶切、基因测序鉴定证实。本研究结果显示，空转染组可观察到较强的红色荧光，空白对照组没有观察到红色荧光，而转染组红色荧光强度介于空转染组与空白对照组之间；红色荧光蛋白基因位于Thoc1基因下游，与Thoc1基因共用一个启动子，因此本研究结果证实Thoc1在HeLa细胞中有表达。本研究采用免疫荧光技术观察到细胞核中存在Thoc1与ClC-3蛋白共定位，提示二者在细胞核中可能存在相互联系。ClC-3是与Thoc1直接结合还是通过其他蛋白分子进行间接连接，仍需要进一步研究。由于Thoc1在转录过程中发挥重要作用，提示ClC-3也有可能参与了细胞核中的转录过程，或具备参与细胞转录、RNA加工的功能。

综上所述，本研究成功构建了pThoc1-DsRed2-N1真核表达载体；Thoc1与ClC-3共定位于HeLa细胞核，提示ClC-3可能参与细胞转录过程。

参考文献：

[1] Chinnam M, Wang X, Zhang X, et al. Evaluating effects of hypomorphic Thoc1 alleles on embryonic development in Rb1 null mice[J]. Mol Cell Biol, 2016,36(11):1621-1627.

[2] Li Y, Wang X, Zhang XD. Human hHpr1/p84/Thoc1 regulates transcriptional elongation and physically links RNA polymerase Ⅱ and RNA processing factors[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(10):4023-4033.

[3] Li Y, Lin AW, Zhang X, et al. Cancer cells and normal cells differ in their requirements for Thoc1[J]. Cancer Res, 2007,67(14):6657-6664.

[4] Yang J, Li Y, Khoury T, et al. Relationships of hHpr1/p84/Thoc1 expression to clinicopathologic characteristics and prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Ann Clin Lab Sci, 2008,38(2):105-112.

[5] Hong S, Bi M, Wang L, et al. ClC-3 channels in cancer[J]. Oncol Report, 2015,33(2):507-514.

[6] 秦建民.信号调节蛋白在生物信号转导中的作用及意义[J].医学分子生物学杂志, 2002,24(1):41-44.

[7] Wang X, Chang Y, Li Y, et al. Thoc1/Hpr1/p84 is essential for early embryonic development in the mouse[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(11):4362-4367.

[8] Liu C, Yue B, Yuan C, et al. Elevated expression of Thoc1 is associated with aggressive phenotype and poor prognosis in colorectal cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,468(1-2):53-58.

[9] Wan J, Zou S, Hu M, et al. Thoc1 inhibits cell growth via induction of cell cycle arrest and apoptosis in lung cancer cells[J]. Mol Med Rep, 2014,9(6):2321-2327.

[10] Guo R, Pan F, Tian Y, et al. Down-Regulation of ClC-3 expression reduces epidermal stem cell migration by inhibiting volume-activated chloride currents[J]. J Membr Biol, 2016,249(3):281-292.

[11] Hermoso M, Satterwhite CM, Andrade YN, et al. ClC-3 is a fundamental molecular component of volume-sensitive outwardly rectifying Cl- channels and volume regulation in HeLa cells and Xenopus laevis oocytes[J]. J Biol Chem, 2002,277(42):40066-40074.

[12] Xu B, Jin X, Min L, et al. Chloride channel-3 promotes tumor metastasis by regulating membrane ruffling and is associated with poor survival[J]. Oncotarget, 2015,6(4):2434-2450.

[13] 邢万金,赵宇航,任仕超,等.红色荧光蛋白DsRed2基因在大肠杆菌中的表达和观察及其在本科实验教学中的应用[J].内蒙古大学学报(自然版),2008,39(5):548-551.

[14] 马骞,甄诚,满江红,等.GGT1基因的真核表达载体构建及其表达定位[J].科学技术与工程,2010,10(22):5490-5492.

[15] Baird GS, Zacharias DA, Tsiein RY. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(22):11984-11989.