福建黄兔微生物和寄生虫感染状况调查与分析

2018-06-14俞春英谢金东王训立福建中医药大学实验动物中心福州350122

福建畜牧兽医 2018年3期

俞春英林玮谢金东王训立福建中医药大学实验动物中心福州 350122

福建黄兔是福建省独有的家兔品种，是长期的地理隔离演变来的。据报道，福建黄兔耐粗饲、繁殖率和成活率高，这对于在养殖业中难度较大的兔类饲养来讲是极其有利的优势[1-3]。福建省连江玉华山兔场是我省福建黄兔的种源基地，该兔场繁殖生产的家兔属于非等级实验兔，饲养于普通的开放环境，主要供肉用和当地高等院校的教学实验用动物。我校长期教学用家兔主要来源于该兔场，鉴于该家兔为非等级实验兔，由于在教学用家兔的使用环节中存在多种可能发生的生物安全隐患，如学生偶尔被抓伤、咬伤，进行采血、灌胃、解剖实验等，倘若发生具有危害性的病原体感染事故，将会严重影响到实验人员及学生的身体健康，甚至带来局部的传播。因此，动物的微生物学和寄生虫学质量控制与我们的实验环境安全和身体健康息息相关。为防范于未然，定期抽查我校所使用的教学实验用家兔的微生物和寄生虫携带情况，以最大程度控制和避免教学生物安全事故的发生[4-6]。

1 材料与方法

1.1 实验动物福建省连江县玉华山种兔场饲养的4月龄福建黄兔，四批次动物按春、夏、秋、冬四个季度采样，每季度随机挑选25只，于我校实验动物中心[SYXK(闽2014-0006)]适应性饲养一周，观察无异常症状表现后进行相关项目的检测。

1.2 试剂及设备

1.2.1 细菌检测试剂 SF培养基、NAC养基、高盐甘露醇培养基、DHL培养基、血琼脂平板、生化鉴定管购自广州环凯微生物科技有限公司；兔泰泽病原体抗体检测试剂盒购自苏州西山生物技术有限公司；戊巴比妥钠由索莱宝生物科技有限公司分装，批号为1014P034和701O034。

1.2.2 病毒检测试剂兔出血症病毒检测ELISA试剂盒购自Express BIO。

1.2.3 寄生虫检测试剂弓形虫间接血凝试验（I-HA）试剂购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2.4 其他试剂其他试剂均采用国产分析纯或进口分析纯试剂。

1.2.5 主要仪器设备生化培养箱（MIR-254，日本三洋）；生物光学显微镜（E100，尼康）；全自动酶标仪（ELX808，美国宝特）；洗板机（ELX50，美国宝特）；高压灭菌锅（MLS-3750，日本三洋）；超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰）；电热恒温干燥箱（DHG-9053A，上海一恒）。

1.3 检测程序动物→编号→外观检查（正常）→皮肤取样（体外寄生虫检查）→采血（分离血清，检查病毒抗体和其他病原的抗体）→麻醉→无菌解剖→增菌分离培养→生化鉴定、血清学鉴定→结果判定。

1.4 寄生虫检测

1.4.1 体外寄生虫检测依据国家标准GB/T 18448.1-2001[7]，采用拔毛法，逐只在兔的体表如耳、背、腹股沟等体外寄生虫易感部位拔取少量被毛，分别散放在载玻片上，用透明胶粘住，编号，记录取样部位，保存于4℃冰箱。为避免虫体降解需2 d内检测完毕，所有玻片于显微镜下观察，每一玻片重复观察一次，并记录结果。

1.4.2 体内寄生虫检测依据国家标准GB/T 18448.2-2008[8]，清醒状态采兔耳静脉血，分离血清，按弓形虫抗体、出血症病毒抗体、泰泽病原体抗体检测所需的血清量分装，编号，-80℃冻存。使用购买的弓形虫间接血凝试验（IHA试验）的冻干抗原，定性检测兔血清中的弓形虫抗体。检测步骤：用微量加样器在96孔有机玻璃反应板的每孔中加稀释液，每个样品需加4孔稀释液，同时设阳性血清、阴性血清、空白对照；加待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清；样品稀释至第3孔，对照血清均稀释至第7孔；将诊断液摇匀后加入每个孔，然后将反应板置微型振荡器上振荡1～2 min，取下反应板，盖上与板大小相近的玻璃罩，置37℃作用2～3 h后观察结果。结果判定：在阳性对照血清效价不低于1∶1 024，阴性对照血清除第1孔允许有前滞现象“+”，其余各孔均为“-”，稀释液对照为“-”的前提下，对待检血清进行判定，待检血清效价达到或超过1∶64判为阳性，否则为阴性。

另收集兔粪球，每只数粒，装入自封袋，编号，4℃冰箱冷藏，采用漂浮法和沉淀法检测粪便中的线虫，一周内检测完毕。

1.5 病毒检测依据国家标准 GB/T14926.21-2001[9]，采用ELISA试剂盒检测兔出血症病毒。操作步骤：1∶50稀释血清样本，同时每个检测项目均设阳性病毒抗原孔及阴性对照抗原孔；一抗孵育，在已包被抗原的ELISA微孔条上标上序号，再向ELISA微孔板中阳性病毒抗原孔及阴性对照抗原孔各加稀释好的样本及阴性、阳性对照，贴上封板膜，置37℃孵育45 min；洗板5次，吸水纸上拍干；每孔加入酶标二抗，贴上封板膜，置37℃孵育45 min；洗板步骤同上；显色，加入 ABTS酶底物，室温反应30 min；读板，加入终止液反应2 min，并在15 min内用酶标仪读数，测试波长为405 nm。结果判定：阴性对照血清的抗原孔读数减去对照抗原孔读数必须＜0.250、阳性对照血清抗原孔减去对照抗原孔读数必须≧0.600时，本次试验结果有效。样本孔读数OD值减去对照抗原孔OD值≧0.300时判为阳性，否则为阴性。

1.6 细菌检测按照国家标准GB/T 14926.1-2001[10]、GB/T 14926.5-2001[11]、GB/T 14926.14-2001[12]、GB/T 14926.17-2001[13]、GB/T 14926.10-2008[14]的方法，3%戊巴比妥钠耳静脉麻醉兔，在超净台上无菌解剖兔，挑取少量回盲部内容物分别接种SF增菌液、高盐甘露醇培养基、NAC培养基，同时挑取少量气管分泌物划线接种血琼脂平板，然后增菌分离培养，结合生化鉴定和血清学鉴定，分别检测该种兔场兔的沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌感染情况。使用ELISA试剂盒检测兔血清中泰泽病原体的抗体，步骤与兔出血症病毒抗体检测类似。

2 结果

2.1 福建黄兔体内外寄生虫检测四批次家兔体内寄生虫检测结果均为阴性，说明该家兔群体没有弓形虫病原的感染，兔粪球中也未查到线虫，但四批次均有不同程度的体外寄生虫（螨虫）感染，结果见表1。

表1 福建黄兔体外寄生虫（节肢动物）、弓形虫、线虫检测结果

2.2 福建黄兔出血症病毒检测该兔场有实施兔出血症病毒的免疫程序，四批次福建黄兔的出血症病毒抗体检测均为阳性，表明经过免疫的福建黄兔能很好地得到抗体的保护，避免感染出血症病毒。结果见表2。

表2 福建黄兔出血症病毒抗体的检测结果

2.3 福建黄兔细菌学检测四批次共100只黄兔的细菌检测结果均为阴性，表明该群体无沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、泰泽病原体的流行，符合国家标准规定的普通级家兔的细菌检测标准，不存在普通级家兔所要排除的人畜共患病和动物烈性传染病病原体。但据悉该兔场有实施一定的细菌免疫程序，因此，还无法达到国家标准中规定的不能免疫又必须阴性的要求，仅能作为实验用动物，结果见表3。

3 讨论

近几年在高等院校发生了多起因实验动物所引发的教学生物安全事故，因此，在高校及科研院所的科研和教学动物实验中提高生物安全意识，警惕生物安全事故的发生显得极其重要。由于我省没有正规的实验兔供应机构，所有标准等级的科研用兔均购自北京、上海等地，导致提高动物成本和延长供应时限。我校每年教学兔用量达1 000只左右，教学兔用量大，而教学实验对动物质量要求不高，受制于教学实验经费和使用的便利性，因此，该兔场繁殖生产的非等级福建黄兔就成为我校教学用家兔的主要供应来源。目前，福建黄兔为非等级家兔，饲养于普通开放环境中，为了预防动物疫病及防范教学动物实验的生物安全事故，有必要了解该兔的微生物和寄生虫流行情况，为此开展了该项调查研究。

由于微生物和寄生虫的流行情况往往有季节性特点，为了全面了解不同季节该兔的微生物和寄生虫感染情况，本试验按季度对兔场的生产繁殖群进行抽检采样，参照实验动物国家标准中普通级家兔的检测要求选择检测项目[15]，另增加多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、泰泽病原体项目。

结果表明，抽查的四批次福建黄兔未发现感染沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和泰泽病原体，每只兔都检测到出血症病毒保护抗体，100只福建黄兔均无弓形虫感染，但体外寄生虫螨虫的平均检出率达36%。由此可知，福建黄兔不存在人畜共患病和烈性传染病的病原体感染，兔的健康状况良好。但该兔场的兔体外寄生虫如螨虫的感染率较高，可能是因为饲养于普通环境，且该兔场生产的家兔大部分供作肉用，在饲养上未达到国家标准中普通级家兔的饲养环境标准和饲养管理要求。此外，也不能排除兔在运输过程和饲养于我校动物中心这一阶段所带来的微生物和寄生虫感染的可能，因此，今后若进行阶段性的抽查，需到现场采样以排除这一可能。螨虫的存在虽不会对环境和人体造成致命性危害，但影响动物的质量和人的身体健康。而要消除螨虫感染，需从净化种群、净化饲养环境和加强饲养管理入手，但对于这类非等级的实验动物生产供应商的地方性养殖场而言是难以实现的。因此，要改变教学实验用家兔的现状，首先，需从学校层面出发，提高教学实验经费，购买标准的实验动物用于教学；其次，提高学校师生的生物安全意识，培养学生的规范操作技能和习惯；最后，学校需要制定相应的应急预案，从而最大程度避免教学生物安全事故的发生，以保障实验环境不被致病性生物污染、师生健康不受伤害[16]。