CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在动物细胞系构建中的应用

葛玉凤 安芳兰 刘学荣 崔治亮 田波

摘要 CRISPR/Cas9[Clustered  regular  interspaced  short  palindromic  repeats（CRISPR）/CRISPR-associated protein 9]系統是广泛存在于细菌和古生菌中可降解入侵病毒和噬菌体DNA的一种基因定点编辑技术，由于其具有快速、精准、高效，易于设计，且特异性高等优势，得到了广泛的应用。概述了CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展历程，并介绍其结构和编辑原理、在动物细胞系构建中的应用及展望，以便为更合理地应用和改进该技术提供系统的文献参考。

关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术;动物细胞系;构建

中图分类号 Q789文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0009-02

1 CRISPR/Cas9的基因座结构和编辑原理

20世纪80年代，日本学者Nakata在大肠杆菌基因组中发现了一系列的短的间隔序列[1]，但其功能一直未研究清楚。随着基因测序技术的发展，人们发现这些重复序列广泛存在于细菌和古细菌基因组中，2002年将其正式命名为CRISPR。直到2008 年，CRISPR/Cas9才被证明具有免疫能力，在E.coli中成熟的crRNAs引导形成Cas蛋白复合体，从而抑制病毒的增殖[2]。2012年，由RNA介导的基因组编辑技术CRISPR/Cas9正式建立，并完成了在哺乳动物细胞中的基因组编辑[3-5] 。

基因编辑技术是通过基因的定点突变，以小片段的删除及目的基因的插入等方式对基因组进行精确修饰的一种技术，是研究基因功能的重要手段。基因编辑技术经历了一个长期而艰巨的研发历程，锌指核酸酶（ZFNs）是第一代人工核酸内切酶，较传统的基因敲除技术易于操作，效率高，周期短，曾被应用于动物和细胞的定点修饰和基因敲除，但随着基因研究技术的发展，ZFNs技术在实际应用中存在制备繁琐，效能低，成本高的缺点，因此，TALEN技术应运而生。2011年，TALEN技术成功应用于目的基因的编辑[6-8]，该技术应用简单高效，细胞毒性较小，被广泛应用于动植物细胞、人细胞及斑马鱼等模式生物的研究中，但该技术的靶点模块建立较复杂，耗时较长。截至2013年，Cong和Mali将CRISPR/Cas9系统成功应用于人类和小鼠基因组编辑，第三代人工核酸内切酶技术- CRISPR/Cas9技术诞生，并迅速成为各国学者研究的重点基因编辑技术，广泛应用于各种模式动物模型和细胞系的建立。

CRISPR/Cas9是存在于大多数细菌和古生菌中的一种获得性免疫系统。由多个重复序列和非重复的间隔序列组成，主要包括R-S结构和编码cas的基因操作子。R-S结构具有特异性识别外源DNA的功能，cas基因家族可编码多功能的CRISPR蛋白，并与成熟的crRNA共同作用[9]构建抵御外来病毒入侵的免疫屏障。根据CRISPR/Cas9系统中cas蛋白的不同，将CRISPR/Cas9系统分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 种类型。I型和III型CRISPR/Cas9系统需要多个Cas蛋白的参与，Ⅱ型CRISPR/Cas9系统仅需要Cas9蛋白即可对DNA特定位点进行修饰，是目前研究的最彻底，也是应用最为广泛的。其作用机制主要通过三个阶段实现：获得CRISPR可变间隔序列、转录crRNA前体与加工crDNA、crRNA-tracrRNA-Cas9复合体剪辑外源性DNA[10]。与传统的ZFN、TALEN基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统通过设计不同的RNA向导对基因进行定点修饰，操作简单易行，高效，基因修饰可遗传，无物种限制，实验周期较短，成本较低，对细胞毒性较小，适合于多基因、高通量的操作，可应用在各种不同的细胞和模式生物中，且发生同源重组的概率比自然发生同源重组的概率高。

2 CRISPR/Cas9技术在动物细胞系构建中的应用

随着CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究深入和不断完善，该技术已成为动植物基因功能研究、建立细胞系和疾病模型的主要手段，尤其在动物细胞系的建立方面起到了重要的作用，目前，该技术在动物细胞系建立中的应用主要包括基因敲除、基因插入和基因修饰3个方面。

2.1 基因敲除

我国科学家针对猪的酪氨酸酶、PARK2 和PINK1 基因的外显子设计了Cas9 打靶质粒，获得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及PARK2 和PINK1 双基因敲除的细胞系，该细胞系用于体细胞核移植后，成功培育出酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2 和PINK1 双基因敲除猪，建立了人类白化病和帕金森综合征2种猪模型，该研究团队首次将CRISPR/Cas9技术与体细胞克隆相结合，实现了大型家禽双基因的等位敲除，这对于人类遗传性疾病的研究有重大意义[11]。近期，又有中国学者通过CRISPR/Cas9 技术成功构建了酪氨酸酶（TYR）等位基因突变的猪胎儿成纤维细胞系和PARK2 和PINK1双基因knock-out 的细胞系，成功培养出基因突变的个体，并可稳定遗传给下一代。韩秋影等[12]利用CRISPR/Cas9 技术实现了细胞水平的基因敲除技术，同时构建了能稳定表达Cas9蛋白的HEK293细胞，并运用CRISPR/Cas9基因转录激活技术，使得HEK293 细胞cGAS基因的转录激活。MEIS2（一种高度保守的同源盒转录因子）可广泛调控胚胎的早期发育和肿瘤的发生，研究者[13]通过设计2个靶向sgRNA，介导外源Cas9蛋白与基因特异性位点结合，构建了可稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。

2.2 基因敲入

传统的基因定点敲入是通过同源重组的方式将目的基因整合到细胞基因组中，筛选产量较高的单克隆，但此方法无法精确控制基因的插入位点，因此整合效率较低。CRISPR/Cas9 技术为构建稳定高产的重组细胞提供了可行性。有研究发现CTCF（脊椎动物关键的绝缘子蛋白）对动物细胞基因表达调控起着重要的作用，其缺失会导致小鼠胚胎死亡。通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组技术，将MD（有丝分裂期特异性降解结构域）敲入CTCF表达框上游，从而带动CTCF蛋白周期性持续降解，获得了CTCF蛋白特异性降解细胞系[14]，体现了CRISPR/Cas9技术对基因组改造的简易性和特异性。段宇红[15]等将4种不同的表达PCV2（猪圆环病毒）功能蛋白基因定点插入到PK15细胞的Rosa26位点，从而建立了稳定的可表达PCV2的细胞系，为研究PCV2病毒在哺乳动物细胞中复制水平低的机制奠定了基础。

2.3 基因修饰

WHO统计结果显示，目前世界上有近6 000多种疾病与基因发生异常相关，但在临床上仍缺乏有效的治疗体系，由于干细胞具有较强的可塑性和重建能力，因此干细胞基因修饰技术成为构建疾病模型、筛选靶向药物和制备治疗型干细胞的关键技术，也成为了人类基因疾病治疗的新希望。王晔博[16]等利用CRISPR/Cas9系统编辑原理，在人的多功能干细胞WAN基因第6个内含子的高突变位点区域，设计了2个gRNAs，通过IDLV携带模板序列的方法筛选出了同源重组子，其正确率达50%，有效优化了人多功能干细胞中基因编辑效率，为研究发育生物学和某些疾病的机理提供了操作平台。有学者[17]利用Cas9核酸酶在sgRNA 介导下可引起基因组DNA双链断裂，从而形成同源重组修复的特性，构建了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系，为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。韩笑等[18]利用gRNA定位，引導Cas9蛋白精确定位进行DNA剪切，并启动DNA自我修复机制，建立了能稳定表达Cas9蛋白的小鼠胚胎干细胞系，实现了多个位点的同时编辑，同时运用Cas9核酸酶在DNA双链上精确剪切DNA，降低了Cas9剪切DNA的脱靶率，有效提高了应用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行基因编辑的效率。

因此，高效的基因编辑技术和精确的基因操作方法为构建所需的细胞系提供了必要的手段。目前，CRISPR/Cas9 技术作为近几年兴起的第三代基因编辑技术，日渐广泛应用于病毒基因组的编辑、细胞系的建立及人类疾病模型的研究等各领域，提供了一种简单高效的基因重组的筛选方法，极大地推动了基因工程技术的应用研究。

3 展望

CRISPR/Cas9 技术已开发为具有多功能的技术，但在长期的研究应用中发现，CRISPR/Cas9 技术在动植物细胞基因改造及其他应用方面存在着脱靶的风险。而且在基因编辑过程中，CRISPR/Cas9产生DNA双链断裂的同时可能激活p53蛋白通路，从而导致基因编辑失败，在临床治疗中产生风险。因此，结合以上对CRISPR/Cas9系统结构和编辑原理、在动物细胞系建立中的应用及存在的问题等现状的分析，可进一步完善CRISPR/Cas9系统在干细胞中的同源修饰效率、在干细胞中对遗传性P-globing异常疾病的基因治疗及p53基因功能监控等方面的研究，最终为生物医学领域的疾病研发、精准医疗和个体化医疗提供服务。

参考文献

[1] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al.Nucleotide sequence of the iap gene，responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli，and identification of the gene product[J].J Bacteriol，1987，169（12）：5249-5433.

[2] MAKAROVA K S，GRISHIN N V，SHABALINA S A，et al.A putative RNAinterferencebased immune system in prokaryotes：Computational analysis of the predicted enzymatic machinery，functional analogies with eukaryotic RNAi，and hypothetical mechanisms of action[J].Biol Direct，2006，1：7.

[3] CONG L，RAN F A，COX D，et al.Multiplex genome engineering  using CRISPR/CasR systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.

[4] MALI P，YANG L H，ESVELT K M，et al.RNAguided human genome engineering via Cas9[J].Science，2013，339（6121）：823-826.

[5] SANDER J D，JOUNG J K.CRISPRCas systems for editing，regulating and targeting genomes[J].Nature biotechnology，2014，32（4）：347-355.

[6] LI T，HUANG S，JIANG W Z，et al.TAL nucleases（TALNs）：Hybrid proteins composedof TAL effectors and FokI DNAcleavage domain[J].Nucleic Acids Res，2011，39（1）：359-372.

[7] MILLER J C，TAN S Y，QIAO G J，et al.A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J].NatBiotechnol，2011，29（2）：143-148.

[8] MAHFOUZ M M，LI L X，SHAMIMUZZAMAN M，et al.De novoengineered transcription activatorlike effector（TALE）hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates doublestrand breaks[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（6）：2623-2628.

[9] BHAYA D，DAVISON M，BARRANGOU R.CRISPRCas systemsin bacteria and archaea：Versatile small RNAs foradaptive defense and regulation[J].Annu Rev Genet，2011，45：273-297.

[10] GARNEAU J E，DUPUIS M，VILLION M，et al.The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage andplasmid DNA[J].Nature，2010，468：67-71.

[11] 科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型[J].中国畜禽种业，2014（12）：149.

[12] 韩秋影，蔡宏薛文，等.CRISPR/Cas9 基因转录激活技术的建立及其应用[J].科学技术与工程，2016，16（20）：22-25，36.

[13] 卢利莎，白杨，刘鑫，等.利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系[J].中国细胞生物学学报，2015，37（4）：535-541.

[14] 谢德健，师明磊，张彦，等.利用 CRISPR/Cas9 技术构建 CTCF 蛋白降解细胞系[J].遗传，2016，38（7）：651-657.

[15] 段宇红.CRISPR/Cas9介导的PCV2功能蛋白基因的定点敲入的初步研究[D].长沙：湖南农业大学，2016.

[16] 王晔博.CRISPR/Cas9靶向编辑技术的优化及其在干细胞中的应用[D].杭州：浙江大学，2016.

[17] 吴福仁，康雪晴，庄园，等.CRISPR/Cas9 介導的CD34 报告基因293AD 细胞系的构建[J].基因组学与应用生物学，2016，35（3）：472-478.

[18] 韩笑，刘洋洋，袁君婷，等.诱导表达Cas9小鼠胚胎干细胞的建立及其应用[C]//中国遗传学会.中国的遗传学研究 遗传多样性：前沿与挑战--2015中国遗传学会大会论文摘要汇编.昆明：中国遗传学会，2015.