甘草内生真菌的分离及抑菌活性研究

杨林，王磊, 胥彤，何俊杰

兰州理工大学 生命科学及工程学院,甘肃 兰州 730050

1.绪论

甘草是中国2000多种草药中用量最大的一种传统中药材，具有调和诸药、益气补脾、祛痰止咳、清热解毒、预防癌症等功效，素有“十方九草，无草不成方”之说[1]。乌拉尔甘草具有明显抗病毒[2]、抗炎[3]、抗菌及抗血栓[4]等作用。本实验旨在研究甘草根内生真菌分离鉴定及其代谢产物抑菌活性研究，筛选出甘草抑菌活性内生真菌，为甘草资源综合开发利用奠定基础。

1.1 甘草药理作用研究现状

（一）抗菌与抗病毒活性：甘草多年临床应用于病毒性呼吸系统疾病、肝炎、呼吸系统感染、口腔溃疡等多种细菌或病毒性疾病，提示甘草可能具有良好的抗菌和抗病毒作用。现代试验表明，甘草的水提取部位、甲醇提取部位、超临界提取物都具有一定的抗菌活性，对多种革兰阴性菌、革兰氏阳性菌均表现出一定的抑制作用[5]。

（二）抗炎作用：甘草具有皮质激素样抗炎作用。甘草水煎剂能抑制被动皮肤过敏反应，降低小鼠血清IgE抗体水平，但对SRBC致IgG抗体的产生无影响[6]。

（三）抗病毒作用：甘草甜素对人体免疫性缺陷病毒(HIV，艾滋病毒)，肝炎病毒及水痘，带状疱病毒等的增殖有抑制作用[6]。

（四）抗癌活性：甘草提取物可直接有效抑制乳腺癌、欧利希肿瘤、埃列希腹水肿瘤、子宫内膜癌及多种实体瘤的生长和细胞增殖，同时还能有效抑制肺癌的转移[5]。

1.2 内生真菌生物活性研究进展

近些年，植物内生真菌所产生的代谢产物在生物医学方面研究成为热点，内生真菌作为一种潜力巨大的微生物资源，从其代谢产物中筛选寻找有价值的先导化合物已成为新药研发的重要途径和来源。国内外研究发现，植物内生真菌能够产生抗生素类、抗氧化类、抗肿瘤类[7]等其他活性物质。

2.材料与方法

2.1 植物材料

乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)，于2015年11月购于甘肃民勤，由兰州理工大学生命学院杨林副教授鉴定。

2.2 甘草内生真菌的分离及鉴定

将乌拉尔甘草的根冲洗干净,用75%的乙醇泡12min,用无菌水冲洗三次，再用3%的NaClO浸泡15min，用无菌手术刀在超净工作台将其切成1cm的小段，将其放置于PDA培养基表面，在27℃的培养箱中培养3-7d,定期观察,当切口处长出菌落时及时将菌落挑入新的PDA培养基中纯化[8]。将真菌接种到平板上，插上灭菌的盖玻片，生长完全后放于载玻片上，在光学显微镜下观察菌落、菌丝体、孢子形态。根据《真菌鉴定手册》 初步鉴定。

2.3 次级代谢产物的制备

将分离得到的内生真菌接种于PD培养基中，在27℃ 120r/min的空气浴摇床中培养10d，将得到的发酵液抽滤，将菌丝体放入干燥箱中烘干备用，菌液分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，将有机层的萃取物收集并用旋转蒸发仪浓缩备用；将干燥的菌丝体用研钵研磨均匀后用30倍体积的甲醇回流提取3次，每次1h，过滤，合并甲醇提取液，用旋转蒸发仪将其浓缩备用，将乙酸乙酯、正丁醇、甲醇三种部位的样品放入50℃条件下干燥至恒重[9]。

2.4 抑菌活性测定[10]

采用滤纸片法测定各样品抑菌活性，将5种指示菌（金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，绿脓杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌）在37℃恒温培养24h，活化后用无菌水配置成菌悬液，调节菌体浓度至106CFU/mL,吸取1mL均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，取直径为6mm的无菌滤纸片，在无菌条件下用镊子放置于上述已涂布的平板上，每皿3片，轻压使其与培养基表面接触，然后用微量移液器吸取备好的各测试样品溶液（以甲醇稀释至10mg/mL）15µL分别滴加于纸片上，以溶剂甲醇为阴性对照，以100U/mL的硫酸链霉素或青霉素钠为阳性对照，每个样品设三个平行。加样后于37℃培养24h，十字交叉法测定各样品抑菌圈大小。

最小抑菌浓度（MIC）的测定，选择对样品溶解度好且无抑菌作用的甲醇作为溶媒，采用二倍稀释法将样品制为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.313mg/mL系列浓度溶液，用滤纸片法测定抑菌圈直径，以本实验组中出现抑菌圈的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。

3.结果与分析

3.1 甘草内生真菌分离及鉴定结果

本实验从甘草根分离得到15株内生真菌，通过形态及显微鉴定（菌落形态、边缘、基质颜色、菌丝形态）共鉴定8株内生真菌，分5个属，其中菌株R101为毛霉属（Mucor）、菌株R102、R108、R113为镰刀菌属（Fusarium）、菌株R105、R09为曲霉属（Aspergillus）、菌株R106为青霉属（Penicillium）、菌株R107为木霉属（Trichoderma）。

3.2 内生真菌代谢产物抑菌活性结果

抑菌实验结果表明：甘草内生真菌发酵产物对各指示菌均有不同的抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌表现出抑菌活性的样品占总数46.7%；对绿脓杆菌表现出抑菌活性的样品占总数42.2%；对肺炎克雷伯菌表现出抑菌活性的样品占总数40%；对大肠杆菌表现出抑菌活性的样品占总数44.4%；对地衣芽孢杆菌表现出抑菌活性的样品占总数28.9%。

活性样品最小抑菌浓度测定结果见表1，样品R108(NBE)、R108(MME)、R109(EAE)、R109(NBE)、R109(MME)对绿脓杆菌具有较强的抑菌活性，其中R108（NBE）、R108（MME）、R109(EAE)的最小抑菌浓度分别为0.625mg/mL、0.312mg/mL、1.25mg/mL；R109（NBE）和R109（MME）最小抑菌浓度为2.5mg/mL。

表1最小抑菌浓度测定结果

4.结论

本研究从甘草根分离得到15株内生真菌，形态及显微鉴定8株，初步判断为毛霉属、镰刀菌属、曲霉属、青霉属、木霉属，其中镰刀菌属为优势菌属。帖卫芳等[11]从甘草根分离内生真菌，并对优势菌落进行鉴定，确定优势菌落分别为镰刀菌属和赤霉菌属。采用滤纸片法测定甘草内生真菌次级代谢产物抑菌活性，结果表明，次级代谢产物3个部位45个样品中有43个样品表现出抑菌活性，占样品总数95.6%。甘草内生真菌具有作为发酵菌株生产活性成分原料的潜力，具有潜在的药用价值。