对氧磷介导氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞

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(1. 南华大学附属第二医院药剂科，湖南 衡阳421001；2.南华大学药物药理研究所)

现代医学研究发现动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是多种心血管疾病的共同病理基础，As的发病机制涉及内皮损伤、脂质浸润、血栓形成等方面，血管内皮细胞氧化应激损伤是As发生的始动环节[1]。有机磷酸酯类化合物(Organophosphares,Org-P)在农业防虫抗害中应用广泛，Org-P的代谢物对氧磷引起血管内皮细胞损伤，引起动脉粥样硬化等疾病的发生发展[2-4]。本文探讨对氧磷(Paraoxon,PO)对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的氧化应激损伤。

1 材料与方法

1.1细胞株人脐静脉内皮细胞株，由南华大学药物药理研究所中心实验室提供。

1.2主要药品与试剂PO购于Dr. Ehrenstorfer GmbH公司(德国)；二甲基亚砜(DMSO)，胰蛋白酶购于Sigma公司(美国)；DMEM购于Gibco(美国)；胎牛血清购于四季清(中国杭州)；BCA蛋白浓度测定试剂，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，细胞裂解液，超敏ECL化学发光试剂盒购于碧云天生物技术公司；CCK8试剂盒购于广州奕源生物公司；抗Notch1兔单克隆抗体，抗Hes1兔单克隆抗体购于Cell Signaling Technology；抗Bcl-2兔单克隆抗体，抗Caspase3兔单克隆抗体，抗Bax兔单克隆抗体购于万类生物科技；抗α-Tublin兔单克隆抗体购于上海瓦兰生物科技；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购于北京康为世纪生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒，丙二醛(Malonaldehyde,MDA)试剂盒，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)试剂盒购于中国南京建诚生物技术有限公司。

1.3 PO刺激HUVECs氧化应激损伤模型建立PO刺激HUVECs氧化应激损伤量效关系实验:取90%融合状态时HUVECs空白对照组、不同浓度PO(300，600，900，1 200，2 400 μm)组和溶媒对照组(0.1%DMSO)培养24 h(每组6个平行孔)。PO刺激HUVECs氧化应激损伤时效关系:通过PO量效关系实验，选取最佳PO刺激终浓度(1 200 μm)为PO时效关系的条件，待HUVECs 90%融合状态时，用1200 μm PO处理HUVECs，分为0，6，12，24 h四组(每组6个平行孔，其中0 h组为含有0.1% DMSO培养基)。

1.4数据分析用Graphpad prism5软件对数据进行分析，用均数±标准差表示。多组数据平均值的差异用单因素方差分析检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PO刺激HUVECs氧化应激损伤量效关系

2.1.1 不同浓度PO刺激引起的HUVECs形态变化 如图1所示，普通光学显微镜下观察空白对照组HUVECs贴壁生长呈鹅卵石样排列，生长状态良好，细胞间紧密连接；细胞呈多角形或短梭形，大小均匀，边界清楚；随PO浓度增加，细胞数量变少，细胞间隔变大，细胞间出现空泡与碎片。PO(300，600 μm)组HUVECs变化不明显，PO(1 200，2 400 μm)组细胞内空泡与碎片较明显且细胞间排列稀疏，2 400 μm组细胞皱缩明显，空泡与裂解碎片增多。溶媒对照组 (DMSO组)对比空白对照组细胞形态没有明显改变。

图1 不同浓度PO刺激24 h后引起HUVECs的形态变化(100×)

2.1.2 CCK8法检测PO对内皮细胞活力的影响 与空白对照组相比，HUVECs经PO处理后细胞存活率降低。设对照组细胞存活率为100%，PO(300，600，900，1200，2400μm)细胞存活率(%)分别为：1.003%±0.094%，0.928%±0.201%，0.760%±0.148%，0.525%±0.105%，0.408%±0.133%。其中PO(900,1200，2400μm)组细胞活力呈剂量依赖性降低(P<0.01)；溶媒DMSO组与空白组相比，细胞存活率(0.885%±0.186%)下降不明显(P>0.05)。

图2 不同浓度的PO刺激24 h后对HUVECs活力的影响(n=6)与空白对照组比较,*P<0.05

2.1.3 不同浓度PO对HUVECs中SOD活性、MDA、LDH含量的影响 HUVECs与不同浓度的PO(300，600，900，1 200，2 400μm)共同孵育24 h，测定培养液SOD活性、MDA、LDH含量。结果如表1所示：与空白对照组相比，PO(600，900，1 200，2 400 μm)组细胞中SOD活力呈现浓度依赖性减弱(P<0.01)，溶媒对照组(DMSO组)变化不明显(P>0.05)；PO(900，1 200，2 400 μm)组MDA、LDH含量呈现浓度依赖性升高(P<0.01)，溶媒对照组(DMSO组)MDA、LDH含量无明显变化(P>0.05)。

表1 PO对HUVECs培养液中SOD、MDA、LDH的影响(n=6)

与空白对照组比较,aP<0.05

2.1.4 不同浓度PO对 HUVECs凋亡相关蛋白表达的影响 结果如图3，图4显示，不同浓度PO损伤HUVECs 24 h，通过Western blot法检测各凋亡相关蛋白(Notch1、Hes1、Bcl2、Caspase3、Bax)表达；结果表明，与空白对照组相比，PO(1 200，2 400μm)组Notch1、Hes1、Caspase3、Bax表达显著上调(P<0.01)，Bcl-2表达下调，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，溶媒对照组(DMSO组)各凋亡相关蛋白表达变化不明显(P>0.05)。

图3 不同浓度PO刺激HUVECs 24 h后Notch1、Hes1蛋白表达变化(n=3) 与空白对照组比较,*P<0.05

图4 不同浓度PO刺激HUVECs 24 h后细胞Casepase3表达及Bcl2/Bax比值变化(n=3)与空白对照组比较,*P<0.05

2.2 PO对HUVECs氧化应激损伤的时效关系

2.2.1 不同时间PO刺激HUVECs对细胞形态的影响 经前面的量效关系实验可知1 200 μm的PO处理HUVECs，细胞损伤最明显。故选用1 200 μm的PO分别刺激HUVECs不同时间(0，6，12，24 h)后在显微镜下观察，如图5显示，0 h组HUVECs贴壁生长呈鹅卵石样排列，生长状态良好，细胞间紧密连接，细胞呈多角形或短梭形，大小均一，边界清楚；随损伤时间延长，细胞形态逐渐发生变化，细胞内出现空泡与碎片，细胞数目减少，脱落增多。

图5 1 200 μm PO损伤HUVECs不同时间后细胞形态变化(100×)

2.2.2 不同时间PO刺激HUVECs对细胞活力的影响 如图6所示，与0 h组相比， PO(12 h，24 h)组细胞活力呈时间依赖性下降(P<0.05)。

图6 1 200 μm PO作用于HUVECs不同时间对细胞活力的影响(n=6)与0 h组比较，*P<0.05

2.2.3 不同时间PO对HUVECs培养液中SOD、MDA、LDH含量的影响 如表2所示，与0 h组相比，随着PO处理HUVECs时间的延长，细胞内SOD含量逐渐降低，PO(12 h, 24 h)组SOD含量呈时间依赖性显著降低(P<0.01)。与0 h组相比，随着时间延长，细胞内MDA、LDH含量逐渐增加，PO(12 h，24 h)组MDA、LDH含量呈时间依赖性显著增加(P<0.01)。

表2 不同时间PO刺激HUVECs的SOD、MDA、LDH含量的影响(n=6)

与0h比较，aP<0.05

2.2.4 不同时间PO对HUVECs凋亡相关蛋白表达的影响 由图7-8可知，Western blot分析结果显示，与0 h对照组相比，随着PO处理HUVECs时间延长，PO(12 h，24 h)组Notch1、Hes1、Caspase3、Bax表达增加(P<0.05)，同时Bcl-2表达下降，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。

图7 1 200 μm PO作用于HUVECs不同时间后Notch1、Hes1蛋白变化表达(n=3)与0 h组比较，*P<0.05

图8 1 200 μm PO作用于HUVECs不同时间后Casepase3表达及Bcl2/Bax比值变化(n=3)与0 h组比较，*P<0.05

3 讨 论

动脉粥样硬化是一种多因素诱发的疾病，它涉及到年龄、饮食习惯、感染与环境等因素，发病机理十分复杂，至今尚未完全阐明。有文献报道长期与有机磷酸酯类杀虫剂接触对心血管疾病的发生有密切关系[5-6]，还有研究表明长期使用农药的花匠与牧民会增加患心血管疾病的风险[7-9]。LDH是细胞内的糖酵解酶，广泛存在于细胞浆内，培养液中 LDH 漏出增加显示细胞遭到破坏或细胞膜通透性增加，细胞或细胞膜损伤的程度可通过LDH水平高低反映出来[10]。研究表明内皮细胞氧自由基产生脂质过氧化程度的增加时，MDA含量的升高， DNA合成抑制，阻碍内皮细胞损伤修复，促进动脉粥样硬化的发生发展[11]。正常细胞内的SOD 等内源性抗氧化酶系，可通过代谢转化清除活性氧，抑制动脉粥样硬化的发生发展[12-13]。本课题组近年来对有机磷酸酯类农药产生的心血管危害作用及机制做了大量的研究，前期试验已成功建立敌百虫加速的远交群大鼠 (Sprague Dawley Rat, SD Rat)As模型[14]，用有机磷酸酯类农药敌百虫给家兔长期灌胃，发现兔血管形态明显改变以及血管内皮功能的损伤[15]。人体内的一些基因与生理病理条件下的程序式细胞调亡有关，已证实凋亡调节因子参与细胞的调控，Bcl-2基因可抑制多种细胞的凋亡，Bax是细胞凋亡的启动子，Bcl-2/Bax比值反应细胞凋亡的程度；Bax促进Caspase表达，介导细胞凋亡[16-17]。王宁等用姜黄素拮抗内皮细胞的氧化应激反应主要是通过调节Notch1信号通路发挥减轻细胞凋亡的作用[18]。研究发现Notch1信号通路在内皮细胞的间质化、内皮细胞增生以及凋亡过程中发挥着重要作用[19]。有文献报导血管内皮细胞中Notch 1促进Hes 1的表达[20]。

本实验用对氧磷诱导人脐静脉内皮细胞建立氧化应激损伤的模型，发现PO呈浓度与时间依赖性介导人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤，引起内皮细胞的形态改变(如细胞萎缩以及细胞间隙增宽等)，内皮细胞活力SOD明显降低，MDA、LDH含量逐渐增加；本实验也观察到Caspase3、Bax、Notch1、Hes1的表达上调，而Bcl-2表达和Bcl-2/Bax比值下降，PO对内皮细胞产生明显的氧化应激损伤。

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