食管鳞状细胞癌中ARTN、GFRα3的表达及临床意义

陈雅琪，蹇顺海， 黄一凡，文 彬

(川北医学院， 四川 南充 637000)

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，据我国最新流行病学调查报告，其发病率、死亡率均居癌症的第3位，且呈上升趋势[1]。食管癌早期症状不明显，5年生存率仅为15%～25%[2]。目前，尚无能协助食管癌早期诊断及评估随访患者预后的有效的生物标志物。此外,传统的临床病理参数包括肿瘤组织学分级、临床分期和淋巴结转移等，不能全面有效地评估患者预后，因此寻找新的生物学指标尤为重要。

ARTN是胶质细胞源神经营养因子家族成员之一，与其受体GFRα1、 GFRα3结合，再激活下游的络氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase，RET)向细胞内传递信号，但ARTN与GFRα3受体的作用更强，能在多种恶性肿瘤中表达，具有促进肿瘤的生长、转移及新生血管的形成等作用[3]。目前尚无联合检测ARTN与GFRα3在食管癌中的表达及与食管癌的临床病理参数关系的方法，因此本实验检测胶质细胞源神经营养因子ARTN及受体GFRα3在食管鳞癌中的表达及其生物学作用，探讨其与食管鳞状细胞癌的发展及预后关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集川北医学院附属医院2009年1月1日—2010年12月30日存档确诊的食管鳞状细胞癌石蜡标本114例，标本均重新阅片，患者年龄为39～82岁，平均(57.2±4.23)岁。另选取高级别上皮内瘤变标本17例，年龄为42～75岁，平均(59.6±6.37)岁。选取正常食管组织25例(以正常食管切缘代替)作为对照组。所有标本术前均未经放、化疗，术前签署相关知情同意书，符合医学伦理学规定。

1.2 方法

标本均按正常程序取材、固定、制片。ARTN兔抗人单克隆抗体(1∶50)购自Abcam公司。GFRα3兔抗人多克隆抗体购自Atlas公司(HPA020731， 1∶600)。即用型检测试剂、即用型过氧化物酶及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司，两者以胰腺癌标本做阳性对照，组织本身做阴性内对照。采用免疫组化SP两步法检测ARTN、GFRα3蛋白的表达。

1.3 结果判定

ARTN、GFRα3阳性信号定位于癌细胞膜或细胞质，以阳性染色范围及着色强度共同判定。阳性染色范围以阳性细胞所占百分比划分：无细胞着色判为0分；着色范围小于25%为1分；着色范围25%～50%为2分；着色范围50%～75%为3分；着色范围大于75%为4分。着色强度无色为0分；着色浅黄色为1分；着色棕黄色为2分；着色棕褐色为3分。最后由副高以上级别病理医师判定，求两者分数之和。小于等于2分为阴性(-)，3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法

数据分析组间比较采用卡方检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P<0.05判定为差异具有统计学意义。所有统计数据均用SPSS17.0软件分析完成。

2 结果

2.1 ARTN、GFRα3在食管组织中的表达

ARTN和GFRα3表达于细胞质或细胞膜，可见强阳性、中等阳性、弱阳性及阴性表达，结果以阳性及阴性例数计。ARTN在食管正常组织、高级别上皮内瘤变组织、食管鳞状细胞癌组织中的阳性率分别为0(0/25)、23.5% (4/17)、80.7% (92/114)，阳性表达率逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0. 05)。同样，GFRα3在3种组织中的阳性率分别为0(0/25)、29.4%(5/17)、76.3%(87/114)，GFRα3的阳性表达率逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0. 05)。具体情况见图1、2和表1。

图1 ARTN 在食管组织中的表达(SP两步法)

图2 GFRα3在食管鳞状细胞癌中表达(SP两步法)

2.2 ARTN、GFRα3表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系

ARTN、GFRα3两者在食管鳞癌中的表达与肿瘤浸润深度及TNM分期相关(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤部位及分化程度、淋巴结转移无关(P>0.05)，见表2。

表1 不同食管组织中ARTN, GFRα3的表达

注：N为正常食管切缘组织；H代表高级别上皮内瘤变组织；ESCC为食管鳞状细胞癌组织。

表2 ARTN、GFRα3蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系

续表(表2)

2.3 ARTN、GFRα3在食管鳞癌组织中表达的相关性

Spearman等级相关分析结果显示， GFRα3表达水平伴随ARTN表达的增高而增高，二者呈正相关关系(r=0.198，P<0.05)，见表3。

表3 食管鳞状细胞癌中ARTN蛋白和GFRα3蛋白表达之间的关系

3 讨论

胶质细胞源神经营养因子ARTN、GFRα3可在多种恶性肿瘤中表达，促进肿瘤生长、浸润等，发挥致瘤作用，但在各种恶性肿瘤中的作用不尽相同。ARTN在女性生殖系统中子宫内膜癌及乳腺癌中表达与肿瘤发生、发展、浸润深度及转移有关，并能影响癌细胞对药物的反应[3-5]。ARTN表达与肝细胞肝癌肿块大小、复发及预后相关[6]。胰腺癌中，ARTN的表达促进淋巴结转移、周围神经浸润，并与神经浸润的范围和密度相关[7]。Gao等[8]发现：ARTN及受体GFRα1在喉组织中表达，喉鳞癌中表达高于喉息肉组织并与喉鳞癌TNM分期及预后相关，而与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度及淋巴结转移无关，两者表达具有相关性，共同作用促进肿瘤的进展。另外，LI等[9]研究了ARTN与食管癌的关系，指出ARTN在食管鳞癌组织及培养的癌细胞中表达，在癌组织中的表达高于正常组织，但未研究其与食管鳞癌的临床病理之间的关系。

本研究采用免疫组化法检测正常食管组织、高级别上皮内瘤变组织，食管鳞癌组织中ARTN、GFRα3蛋白的表达，结果显示：ARTN在正常食管组织、高级别上皮内瘤变组织、食管鳞癌组织中的阳性表达率分别为0、23.5%、80.7%；GFRα3的阳性表达率分别为0、29.4%、76.3%，表达水平逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果证实ARTN可能有促进食管鳞癌生长的作用。

患者自身不可抗因素(如年龄)及肿瘤的临床病理特点是影响患者预后的重要因素，本次实验研究结果表明：ARTN、GFRα3表达与食管鳞癌浸润深度、肿瘤分期密切相关，即浸润越深，肿瘤分期越高，ARTN、GFRα3蛋白表达越高，表明ARTN、GFRα3可能对促进肿瘤的浸润有重要作用，即一方面通过降解细胞外基质，破坏基膜的完整性，引导癌细胞迁移，从而促进肿瘤生长、浸润[10]，另一方面ARTN可与多种蛋白酶及生长因子反应，促进肿瘤的血管生成，从而增强肿瘤侵袭能力[11]。ARTN、GFRα3与患者年龄、性别、分化程度及淋巴结转移无关。

ARTN属胶质细胞源神经营养因子(glial derived nuerotrofic factor family,GDNF)家族成员之一，其他家族成员包含GDNF、PSPN及NRTN，与相应的配体结合(GFRα1-4)再与RET结合形成复合体并通过多条路径才能在胞内传递信号，发挥生物学作用，其中ARTN能与GFRα1、GFRα3两种受体结合，但与GFRα3结合能力更强[12]。本次实验研究结果表明：ARTN、GFRα3在食管鳞癌中表达具有相关性，两者呈正相关(P<0.05)， GFRα3表达随ARTN表达升高而升高，两者共同作用激活下游信号通路，发挥致瘤作用。

综上所述，ARTN、GFRα3与食管鳞癌发生、发展关系密切，两者可能促进食管鳞癌的恶性程度及进展。 联合检测ARTN和GFRα3的表达对预测食管鳞癌的发生、浸润及判断临床分期有一定参考价值。

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